Herstellung spektroskopischer Mikrofluidikchips zur Mastitiserkennung in Rohmilch

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 6041 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Mastitis ist eine Krankheit, die sich direkt auf die Menge und Qualität der von Milchkühen produzierten Milch auswirkt, was sich negativ auf das Einkommen aus dem Verkauf der Milch auswirken kann. Eine durch diese Brusterkrankung verursachte schwere Entzündung kann zu einer Bildung von bis zu 1 × 106 weißen Blutkörperchen pro Milliliter Kuhmilch führen. Derzeit ist der kalifornische Mastitistest ein beliebter chemischer Inspektionstest, seine Fehlerquote von über 40 % ist jedoch ein wesentlicher Faktor für die anhaltende Ausbreitung von Mastitis. In dieser Studie wurde ein neues mikrofluidisches Gerät entwickelt und hergestellt, um normale, subklinische und klinische Mastitis zu identifizieren. Dieses tragbare Gerät ermöglicht eine präzise und sekundenschnelle Analyse der Ergebnisse. Das Gerät wurde für das Screening somatischer Zellen entwickelt und wurde um einen Färbeprozess erweitert, um somatische Zellen mithilfe der Einzelzellprozessanalyse zu identifizieren. Mithilfe des Fluoreszenzprinzips wurde der Infektionsstatus der Milch ermittelt und mit einem Minispektrometer analysiert. Die Genauigkeit des Geräts wurde getestet und es wurde festgestellt, dass der Infektionsstatus mit einer Genauigkeit von 95 % bestimmt werden konnte, verglichen mit der Genauigkeit, die mit dem Fossomatic-Gerät erzielt wurde. Man geht davon aus, dass durch die Einführung dieses neuen Mikrofluidikgeräts die Ausbreitung von Mastitis bei Milchkühen deutlich reduziert werden kann, was zu einer höheren Qualität und einer profitableren Milchproduktion führt.

Mastitis bei Milchkühen ist ein anhaltendes Problem für Milchbauern, da sie sich direkt auf die Menge und Qualität der Rohmilch auswirkt und zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten führt. Der weltweite jährliche Verlust wird auf rund 30 Milliarden Euro geschätzt1 und setzt sich aus erheblichen Milchverlusten, schlechter Milchqualität, der Eliminierung chronisch infizierter Tiere und gelegentlichen Todesfällen2 zusammen. Mastitis ist eine Entzündung der Brustdrüsen, die durch das Eindringen bestimmter Krankheitserreger, Allergien oder körperliche Traumata3 verursacht wird und zu abnormalen Veränderungen der Brustdrüsen und der Milch führt. Im Allgemeinen gibt es zwei Arten von Mastitis: klinische und subklinische Mastitis. Diese treten aufgrund verschiedener Ursachen auf, darunter bakterielle Infektionen, Wunden mit infektiösen Toxinen oder chemischer Kontakt, wobei die primäre und häufigste Ursache eine bakterielle Infektion ist. Mastitis kann von Rind zu Rind übertragen werden, was zu einer verstärkten Ausbreitung führt. Treten die Symptome einer Mastitis mit Verzögerung in der Erkennung auf, kann dies die Heilung der Milchkuh für etwa zwei Wochen erheblich beeinträchtigen. Dies kann zur Erblindung und zur dauerhaften Unfähigkeit der Kuh führen, Milch zu produzieren. Darüber hinaus umfasst die routinemäßige Behandlung von Mastitis die Verabreichung von Antibiotika zur Behandlung und Vorbeugung der Krankheit, was ein ernstes Risiko einer Antibiotikaresistenz bei der Kuh darstellt. Es gibt zwei Phasen der Diagnose: Die erste umfasst die Beurteilung des Krankheitsstatus, um ihr Vorliegen festzustellen, und die zweite umfasst die Erkennung des Erregers. Bei schwerer Mastitis kann der Krankheitsstatus anhand des Aussehens der Brust und der Milch beurteilt werden. Um auf klinische oder subklinische Mastitis zu prüfen, werden betriebsinterne Screening-Tests zur Analyse der somatischen Zellzahl (SCC) wie der California Mastitis Test (CMT) eingesetzt. Die Bestimmung des SCC von Milch umfasst die Auswertung der somatischen Zellen (SCs) durch Labormikroskopie, wobei die SCs der Milch direkt auf Objektträgern als gefärbte Zellen beobachtet und von einem Bediener gezählt werden. Die Analyse der Ergebnisse mit dieser Methode ist zeitaufwändig und erfordert die Vorbereitung der Probe durch Spezialisten4. Durchflusszytometrie (FCM) kann für die relativ schnelle SCC- und Bakterienanalyse von Milch verwendet werden5; Diese Methode erfordert außerdem die Unterstützung von Fachpersonal für den Umgang mit relativ teurer Hardware, die für die Analyse benötigt wird, und anderen Einwegartikeln.

CMT-Reagenzien können einfach für den Mastitistest verwendet und zur SCC-Abschätzung in einem landwirtschaftlichen Betrieb eingesetzt werden5. Das im CMT verwendete Reagenz ist Natriumalkylarylsulfonat, basierend auf dem Prinzip, dass Nukleinsäuren und die Zellen anderer Elemente in Gegenwart einer hohen SCC- und Gelbildung freigesetzt werden, die leicht nachweisbar ist6,7. Die mit diesem Reagenz erzielten Ergebnisse sind jedoch falsch positiv oder falsch negativ, und für SCC6,7,8 werden geringe Sensitivität und Spezifität beobachtet. Keiner dieser Tests lieferte einen genauen numerischen Wert für den SCC, da die Ergebnisse auf den morphologischen Merkmalen basierten, die das Auge der Testperson wahrnahm, was zu Ungenauigkeiten führte. Darüber hinaus identifizieren diese Tests nicht den beteiligten Erreger und die Virulenz der Infektion, sondern liefern nur positive oder negative Ergebnisse für Mastitis9,10.

Derzeit gibt es SCC-Detektoren wie den Coulter-Zähler (Coulter Electronics Ltd., Luton) und andere automatische Instrumente, die SCC indirekt messen, wie die Zellzähler Fossomatic und DeLaval (DeLaval, Tumba, Schweden). Der Scharzähler ist ein Hochgeschwindigkeitsgerät zur Partikelgrößenanalyse, das nach dem Prinzip eines elektronischen Partikelzählers arbeitet. Bei der Verwendung dieses Zählers wird der zu untersuchenden Milch eine Formaldehydlösung zugesetzt, um die somatischen Zellen zu analysieren und die Fettpartikel durch Behandlung mit einer Lyselösung zu eliminieren, die sich im Größenbereich der Zellen überschneidet11. Weitere automatische Instrumente, die den SCC indirekt messen, sind das Fossomatic 90, das auf Scheibenzytometrie basiert, und das Fossomatic 5000 (Foss Electric, Hillerød, Dänemark), das auf FCM basiert. Bei der FCM wird eine Zellsuspension gefärbt und durch ein beleuchtetes Kapillarröhrchen vor einem Mikroskopobjektiv gedrückt. Jede vorbeiziehende Zelle wird dann von der am Mikroskop angebrachten fotoelektronischen Vorrichtung registriert. Allerdings sind FCM-basierte Maschinen sehr teuer und nur im Labor einsetzbar. Der DeLaval-Zellzähler (DeLaval, Tumba, Schweden) ist ein tragbares Analysegerät zur optischen und automatischen Zählung somatischer Zellen. Diese Methode weist den Nachteil eines hohen Variationskoeffizienten und einer geringen Wiederholbarkeit auf12.

Heutzutage kann die Mikrofluidik-Technologie die Ergebnisse des Mastitisstatus genau analysieren. Mikrofluidische Geräte sind leistungsstarke Werkzeuge zum Nachweis und zur Identifizierung biologischer Partikel aus Proben, insbesondere pathogener. Für den klinischen Bakteriennachweis wurden mehrere Mikrofluidiktypen vorgeschlagen. Beispielsweise wurden Blut und Urin eines Menschen mit einem Mikrofluidikgerät getestet; Die Bakterien E. coli wurden bei hohen Zellkonzentrationen von ihren roten Blutkörperchen getrennt13. Eine mikrofluidische Plattform wurde verwendet, um mehrere pathogene Bakterien zu identifizieren, die zu Harnwegsinfektionen beigetragen haben; Die Genauigkeit der Ergebnisse lag bei über 90 %14,15. Zusätzlich wurde ein automatisiertes Dunkelfeldmikroskop eingesetzt, um gleichzeitig pathogene Bakterien zu identifizieren und zu quantifizieren. Lebende pathogene Bakterien wurden sowohl für die Probenvorbereitung als auch für die Datenerfassung in weniger als 4 Stunden direkt aus den klinischen Proben immobilisiert16. Diese Geräte können auch gleichzeitig die Größe jedes Bakteriums messen17. Vor kurzem wurden zwei mikrofluidische Plattformen zur Trennung von Bakterien aus Blutzellen bei hohen Zellkonzentrationen mithilfe von Akustophorese in Silizium18 und mikrofluidischen Kunststoffchips19 vorgeschlagen, wodurch die Durchsätze für viele klinische Aufgaben hoch genug sind20. Diese Plattformen sind jedoch auf große Hardware zur Verwaltung der Flusskontrolle angewiesen und verfügen nicht über schnelle Erkennungsmöglichkeiten.

Dementsprechend haben wir an der Entwicklung eines neuartigen mikrofluidischen Geräts gearbeitet, das eine einfache Analyse der Ergebnisse auf der Grundlage eines Lab-on-a-Chip-Ansatzes ermöglicht. Der mikrofluidische Chip bestand aus drei Teilen: einem Filter, einem Mischer und einem Detektor, die den Einwegfluss der Probe ohne Behinderung während des Tests ermöglichten. Somatische Zellen wurden gefiltert, um einen Größenbereich von 10–30 μm zu erreichen, und dann mit Acridinorange (AO) gefärbt. Die somatischen Zellen wurden in einem Mikrokanal ausgerichtet, um eine präzise Steuerung der Zellpositionierung und -ausrichtung stromabwärts im Detektionsbereich zu ermöglichen, der mit Glasfasern zur Fluoreszenzmessung ausgestattet war. Dieses Gerät kann zur Identifizierung somatischer Zellen in roher Kuhmilch verwendet werden, indem die Fluoreszenz gemessen wird, die von den Zellen emittiert wird, wenn sie mit einer bestimmten Lichtwellenlänge angeregt werden. Mithilfe des Fluoreszenzsignals können somatische Zellen von anderen Zelltypen unterschieden und der Mastitisstatus in der Milch ermittelt werden. Die Ergebnisse zeigten, dass das Gerät Analysen mit einer Genauigkeit von bis zu 95 % im Vergleich zum Fossomatic-Gerät durchführen kann.

Bei dieser Untersuchung wurde die Rohmilchprobe auf der Grundlage von drei experimentellen Methoden in drei Gruppen eingeteilt: CMT, Fossomatic und die vorgeschlagene Methode (Minispektroskopie). Die Gruppen wurden unter Verwendung der CMT- und Fossomatic-Methoden zu Vergleichszwecken als normal, subklinisch und klinisch gekennzeichnet. Die Vergleichsergebnisse wurden benötigt, um die Wirksamkeit der vorgeschlagenen Methode zu demonstrieren und eine Referenz für die Datenbank bereitzustellen.

Die CMT-Ergebnisse ergaben fünf mögliche Klassen basierend auf dem Gel, das durch die Mischung zwischen Milch und CMT-Reagenz gebildet wird: 0 (negativ), 1 (Spur +), 2 (schwach positiv ++), 3 (deutlich positiv +++) und 4 (stark positiv ++++). Die Fossomatic-Methode klassifizierte die Milch anhand der geschätzten somatischen Zellzahl (SCC), wobei Milch mit weniger als 200.000 Zellen/ml als Premium, Milch mit 200.000 bis < 350.000 Zellen/ml als gut und Milch mit 350.000 bis 500.000 Zellen/ml als gut gekennzeichnet wurde als Standard gekennzeichnet21. Die Datensätze wurden gesammelt, um die mit den CMT- und Fossomatic-Geräten erzielten Ergebnisse zu interpretieren. Bei der Interpretation wurden jedoch große Abweichungen beobachtet, insbesondere zwischen den Graden 1 und 2 sowie zwischen den Graden 3 und 4. Infolgedessen wurde der Stichprobe eine zweite Gruppe von Labels hinzugefügt. Proben, die als Spuren oder schwach positiv eingestuft wurden, wurden unter der Bezeichnung „subklinisch“ gruppiert, Proben, die als eindeutig positiv oder stark positiv eingestuft waren, wurden unter „klinisch“ gruppiert und als negativ eingestufte Proben wurden unter „normal“ gruppiert. Diese Klassifizierung korrelierte mit der Anzahl somatischer Zellen in der Milch. Milch mit einer somatischen Zellzahl unter 200.000 Zellen/ml wurde als normal, Milch mit einer Zahl zwischen 200.000 und 500.000 Zellen/ml als subklinisch und Milch mit einer Zahl über 500.000 Zellen/ml als klinisch gekennzeichnet. Tabelle 1 zeigt die Instanzverteilung pro Klasse und Interpretationen. Die Ergebnisse zeigten, dass die in dieser Studie beobachtete Prävalenz von Mastitis derjenigen ähnelte, die in früheren Untersuchungen in diesem Bereich berichtet wurde22.

Das Mikrofluidikgerät und die Küvettenmethode wurden unter Verwendung von Kaliumpermanganat (KMnO4) als Vergleichsstandardsubstanz bewertet. Die Fähigkeit des Geräts, Milch zu analysieren, wurde im Absorptions-, Transmissions- und Fluoreszenzmodus getestet, wobei im Fluoreszenztest AO-Farbstoff verwendet wurde. Abbildung 1a zeigt die maximale Absorption von KMnO4 während eines Zeitabschnitts zusammen mit seiner positiven und negativen Abweichung von der mittleren durchschnittlichen Absorption bei 523/10 nm23. Abbildung 1b zeigt die Fluoreszenzemissionsspektren einer AO-markierten Zelle, die mit einem Spektrometer gemessen wurden, um das Spektrum des emittierten Lichts bei 525/50 nm24 aufzuzeichnen. Eine KMnO4-Lösung wurde mit einer Konzentration von 10–45 mg/dm3 hergestellt, und es wurden auch Lösungen mit 100 µg/ml AO-Hemisalz (Zinkchlorid) (A6014, Sigma-Aldrich) hergestellt.

Emissionsspektren der Substanzen: (a) Standard-Kaliumpermanganatlösung und (b) Standard-AO-Lösung.

Rohmilchproben wurden von fünf Holstein-Kühen in Nordthailand entnommen. An einem Tag wurden insgesamt 100 ml Rohmilch gewonnen und nach dem Melken einen Tag lang im Kühlschrank bei weniger als 4 °C gelagert, um die Qualität zu bewahren. Die Proben wurden 60 Minuten vor der Messung aus dem Kühlschrank genommen und auf eine Temperatur von 37 °C gebracht. Um sicherzustellen, dass die Bestandteile der Proben gleichmäßig waren, wurden sie bei 40 °C in einem Wasserbad gerührt25.

Abbildung 2 zeigt das Spektroskopiesystem, das zur Erfassung der Fluoreszenzspektren verwendet wird. Das System bestand aus einem Exemplar-Spektrometer (B&W Tek, Inc., USA) mit einem Wellenlängenbereich von 350–1050 nm, einer Quarzküvette mit einem optischen Weg von 2 mm als Probenpool (Yehui Instrument Ltd. Co., China) , ein Probenreservoir (BCH103A B&W Tek, Inc., USA), eine Lichtquelle (BPS101 B&W Tek, Inc., USA) und 100 µm optische Fasern (Ocean Optics, Inc., FL). Der Teststandard wurde auf einem Laptop-Computer ausgeführt (Abb. 1a), während ein Mikrofluidiksystem die Quarzküvette ersetzte (Abb. 1b).

System zur Gewinnung der Fluoreszenzspektren. Analyse von Milch unter (a) Standardsystem (b) Mikrofluidikchip (c) Versuchsaufbau zum Sortieren somatischer Zellen unter Standardgerät (Küvette) und (d) Versuchsaufbau zum Sortieren somatischer Zellen unter Mikrofluidikgerät.

Zur Verbindung von Lichtquelle, Probenreservoir und Spektrometer wurden optische Fasern verwendet. Rohmilchproben wurden hergestellt, indem sie mit AO im Verhältnis 10:1 gemischt und mit Mikropipetten in Quarzküvetten injiziert wurden. Die Küvetten wurden mit der verdünnten Milch gefüllt und in das Probenreservoir gestellt. Fluoreszenzspektren der Proben wurden über einen Wellenlängenbereich von 350–1050 nm mit der BWSpec-Software mit einer Integralzeit von 300 ms, einer durchschnittlichen Zahl von 5 und einer Glättungszahl von 0 gesammelt. Für jede Probe wurden fünf Replikate erstellt. und der Mittelwert wurde als Ergebnis des Standardsystems berechnet.

Für die Analyse von Rohmilch mit dem mikrofluidischen Chipsystem wurden Lichtquelle, mikrofluidisches System und Spektrometer über optische Fasern verbunden. Die Rohmilch wurde mit einer Spritzenpumpe mit einer Flussrate von 100 µL/min in das Mikrofluidiksystem injiziert und die Spektren wurden mit der BWSpec-Software mit der gleichen Integralzeit, Durchschnittszahl und Glättungszahl wie beim Standardsystem gesammelt . Für jede Probe wurden fünf Replikate erstellt und der Mittelwert als Ergebnis des Mikrofluidiksystems berechnet.

Um qualitativ hochwertige Spektraldaten sicherzustellen und die Auswirkungen von Umgebungslärm und Stromverbrauch zu minimieren, wurde das System stabilisiert, indem es vor jedem Experiment etwa 30 Minuten lang eingeschaltet wurde. Während dieser Zeit durfte das Gerät seine Betriebstemperatur erreichen. Um einen konstanten Strom und eine hohe Effizienz der Wolfram-Halogenlampe zu gewährleisten, wurde für die Mini-Spektrometer-Messung die Wolfram-Halogen-Lichtquelle BPS101 verwendet, die eine Aufwärmphase erforderte. Daher war es notwendig, der Lampe ausreichend Aufwärmzeit zu geben, um einen stabilen Wert von etwa 20 Lumen pro Watt zu erreichen, was vergleichsweise höher ist als bei anderen Glühlampentypen.

Anschließend wurden für das Experiment weiße und dunkle Referenzspektren aufgenommen. Das Dunkelreferenzspektrum (FD) wurde durch Ausschalten der Lichtquelle und Verwendung einer undurchsichtigen Haube erhalten. In der Zwischenzeit wurde das weiße Referenzspektrum (FW) durch Messung der Rohdaten von entionisiertem (DI) Wasser erhalten. Die gesammelten Spektren der Milchproben wurden als SP_1 bezeichnet. Die kalibrierten ursprünglichen Absorptionsspektren, TC, wurden unter Verwendung von Gl. berechnet. (1):

Die Absorptionsspektren wurden dann mit destilliertem Wasser bei der maximalen Wellenlänge (λmax) auf 100 % Transmission (T) kalibriert. Die kalibrierten Spektren (TC) wurden in weiteren Analysen wie der spektralen Vorverarbeitung, der Reduzierung der Datendimension und der Modellierung verwendet.

Im Hinblick auf den Testprozess von Flüssigkeitsgeräten für die Spektralanalyse wurden drei Experimente entwickelt, um die Analysefähigkeit des vorgeschlagenen Mikrofluidikgeräts zu bestätigen.

In Experiment 1 wurde ein Standardgerät (Küvette) mit einem Mikrofluidikgerät verglichen, um zu zeigen, dass die Werte der Probe mithilfe einer spektroskopischen Analyse gemessen werden können. Es wurden drei Testmodi durchgeführt, darunter Absorptions-, Transmissions- und Fluoreszenzmodi. Die zum Testen verwendeten Proben waren eine Standardlösung von Kaliumpermanganat für den Absorptions- und Transmissionsmodus und eine 0,01 M Fluoresceinlösung für den Fluoreszenzmodus. Die Fluoresceinlösung konnte Licht im Wellenlängenbereich von 518–520 nm emittieren.

Experiment 2 wurde durchgeführt, um die Fähigkeit des Mikrofluidikgeräts zu testen, Milch mithilfe der Spektroskopie zu analysieren. Das Experiment war in mehrere Tests unterteilt, darunter Lichtabsorptionstests und Lichttransmissionstests zum Vergleich von Milch mit Kaliumpermanganat sowie Fluoreszenztests mit Fluorescein-, AO- und gemischten AO-Milchproben. Darüber hinaus wurde in der Studie eine Küvette eingesetzt, um die Ergebnisse der Fluoreszenztestanalyse zwischen dem Mikrofluidikgerät und der Küvette zu vergleichen und die Milchanalysefähigkeiten des Mikrofluidikgeräts zu bewerten.

Experiment 3 wurde durchgeführt, um verschiedene Arten von Milchproben mit einem Mikrofluidikgerät zu testen und die Ergebnisse mit den Messungen des Fossomatic zu vergleichen. Der Zweck des Experiments bestand darin, zu bestätigen, ob das Mikrofluidikgerät in der Lage war, Unterschiede in Milchproben genauso effektiv zu analysieren wie das Fossomatic, das in Tabelle 1 als Referenz diente.

Die Milchproben wurden durch Einfärben mit AO im Verhältnis 1:10 getestet. AO hat eine maximale Anregungswellenlänge bei 502 nm und eine maximale Emissionswellenlänge bei 525 nm und erzeugt eine grüne Fluoreszenz. AO ist ein nukleinsäurebindender Farbstoff, der Zellen durchdringen und an DNA oder RNA binden kann, wobei er rote Fluoreszenz aussendet. Diese einzigartige Eigenschaft macht AO für die Untersuchung des Zellzyklus nützlich, da es durch Interferenz oder elektrostatische Anziehung mit DNA oder RNA interagieren kann. Der Bindungsprozess ist für DNA und RNA ähnlich, was zu einem ähnlichen Fluoreszenzspektrum führt. Infolgedessen kann AO zur Abbildung primärer Lysosomen und Phagolysosomen verwendet werden, die ihre Produkte enthalten können. Bei der Phagozytose apoptotischer Zellen wird das Färben üblicherweise unter einem Epifluoreszenzmikroskop und FCM durchgeführt. AO-Färbungen eignen sich besonders für das schnelle Screening routinemäßig sterilisierter Proben und werden daher für den mikroskopischen Nachweis fluoreszierender Mikroorganismen in Direktausstrichen aus klinischen und nichtklinischen Materialien empfohlen. Die Färbung sollte bei einem sauren pH-Wert von 5,5 durchgeführt werden, um einen anderen Färbeeffekt für Bakterien zu erzielen, was zu orangefarbenen Flecken führt, während Gewebebestandteile gelb bis grün erscheinen.

Das mikrofluidische Chipdesign wurde mit Layout Editor@ erstellt. Der Mikrokanal wurde als Drei-in-Eins-Struktur zum Filtern, Mischen und Nachweisen von Lymphozyten in Rohmilch von Kühen entwickelt, wie in Abb. 3 dargestellt. Lymphozytenzellen waren zwischen 7 und 18 µm groß und machten 40 % der Rohmilch aus. Lymphozyten wurden durch den Filter der Struktur gefiltert und dann mit AO-Färbung gemischt, die an DNA/RNA in somatischen Zellen bindet. Die Färbung wurde bei einem sauren pH-Wert durchgeführt, um eine unterschiedliche Färbung zu erreichen, wobei Bakterien orangefarbene Flecken und Gewebebestandteile gelbe bis grüne Flecken zeigten. Mithilfe eines Minispektrometers wurden dann Lymphozyten in einer Einzelzellstruktur (Struktur 3) nachgewiesen. Struktur 1 hatte drei Schichten, die Lymphozyten der Größen 100, 50 und 20 µm filterten. Der gesamte mikrofluidische Chip wurde mittels Photolithographie hergestellt und mittels Röntgen- und Weichlithographie auf einem Glaswafer platziert. Der Mikrofabrikationsprozess ist in Abb. 4 dargestellt. Zur Herstellung der Röntgenmaske wurde UV-Laser-Direktschreiblithographie eingesetzt. Eine strukturierte Cr-Maske wurde unter Verwendung von Ti/Cr/Ti auf dem Glassubstrat abgeschieden und AZ P1518-Fotolack wurde auf dieses Substrat aufgeschleudert. Das UV-direkt geschriebene Muster auf dem Substrat wurde dann einer UV-Dosis von etwa 68 mJ/cm2 ausgesetzt. Das Glassubstrat wurde um die strukturierte Cr-Maske herum entwickelt und Ti/Cr/Ti wurde geätzt. Der Fotolack AZ P1518 wurde mit einer Acetonlösung entfernt und die strukturierte Cr-Maske erschien auf dem Substrat. Die Röntgenmaske wurde auf einem Graphitsubstrat hergestellt, das mit 20 µm dicken SU-8-Trockenfolien laminiert und einer UV-Dosis von 50 mJ/cm2 ausgesetzt wurde. Das Graphitsubstrat wurde für die Cr-Maske strukturiert und für die Beschichtung eines Au-Films auf dem strukturierten Graphitsubstrat elektroplattiert. Der mit Au-Muster versehene Graphit der Röntgenmaske hatte eine Dicke von etwa 20 µm für die Röntgenlithographie. Die SU-8-Platten wurden einer Röntgenbestrahlung mit einer Mindestdosis von 100.000 mJ/cm3 unterzogen, um eine Dicke der Platten von 200 µm zu erreichen. Um Einlass- und Auslass-Fluidverbindungen bereitzustellen, wurde ein repliziertes Polydimethylsiloxan Sylgard 184 (PDMS-184) als Master-Formreplikation verwendet. Diese PDMS-Form hatte ein Mikrokanalmuster auf der Unterseite und die Muster wurden mit der Plasma-O2-Methode verbunden. Das Mikrogerät wurde an der optischen Faser befestigt und mithilfe der Minispektrometrie-Methode verbunden, um die Mikrokanalverbindung für das Experiment einzurichten.

Struktur des Mikrokanals zum Sortieren und Zählen somatischer Zellen (Drei-in-Eins-Struktur). Struktur 1 ist das Filtersystem für somatische Zellen, das Lymphozyten mit einer Größe von 7–18 µm und Neutrophile mit einer Größe von 10–15 µm herausfiltert, was 70–95 % der gesamten somatischen Zellen in der Milch ausmacht26. Struktur 2 ist das Mischsystem, das die aus Struktur 1 gefilterten Körperzellen mit AO-Farbstoff mischt. AO wird typischerweise zur Färbung der somatischen Zellmembran verwendet, die bei Betrachtung unter dem Mikroskop die DNA färbt. Die beim Emissionsmaximum emittierte Fluoreszenz betrug 525 nm (grün). Dieses System erfordert keine Inkubationszeit von bis zu 30 Minuten, damit der Farbstoff an der DNA haftet. Das Mischen erfolgt mithilfe eines Mischschemas in Kombination mit einer geeigneten Durchflusskontrolle. Die resultierende Mischung aus Farbstoff und somatischen Zellen wird dann mithilfe einer dritten Struktur analysiert. Die dritte Struktur ordnet die somatischen Zellhüllen so an, dass sie eine einzige Hülle bilden, die mithilfe eines Mini-Spektrometers zur Spektralablesung mithilfe von Fluoreszenzprinzipien analysiert wird. Eine faseroptische Verkabelungsstruktur mit einem 90°-Winkel dient zum Auslesen von Fluoreszenzwerten und ermöglicht so die Analyse der Unterschiede zwischen den einzelnen Milchsorten.

Der Herstellungsprozess für mikrofluidische Chips zur Sortierung und Erkennung somatischer Zellen. (a) Eine Cr-Maske wird mithilfe der Laserdirektschreiblithographie hergestellt. (b) Eine Röntgenmaske wird auf einem Graphitsubstrat erstellt und dann durch Röntgenlithographie auf einem 200 µm dicken SU-8-Fotolack belichtet. (c) Das Mikrokanalmuster wird auf das replizierte PDMS angewendet, um den Mikrofluidik-Chip zu erstellen.

Das mikrofluidische Gerät wurde mit dem Minispektrometer verbunden, um die Absorption, Transmission und Fluoreszenz der Standardsubstanz zu messen und die Genauigkeit des mikrofluidischen Geräts im Vergleich zum Standardgerät (Küvette) zu bestimmen (dargestellt in Abb. 2c, d). . Rohmilch und AO-Farbstoff wurden so gesteuert, dass sie mit einer Geschwindigkeit von 45 µL/min bzw. 15 µL/min in das Gerät strömten, wie in Abb. 5 dargestellt. Die BPS101-Lampe wurde so eingestellt, dass eine Intensität von 35.000 erreicht wurde. Für den Absorptions-, Transmissions- und Fluoreszenzmodus wurden Probenanalysezeiten von 100 ms bzw. 300 ms verwendet.

Mikrofluidisches Gerät zur Klassifizierung somatischer Zellen. (a) Mikrofluidisches Gerät (b) Filter für somatische Zellen (c) Mischer für somatische Zellen (d) Ausrichtung somatischer Zellen auf den Erkennungsbereich (e) Erkennungsbereich.

Die Qualität der Milch wurde mit einem Fotospektrometer gemessen, das nach dem Lichtprinzip funktionierte. Zwei Arten von Geräten – die Standardausrüstung (Küvette) und das vorgeschlagene Mikrofluidikgerät – wurden verwendet, wie in den Abbildungen gezeigt. 6 und 7 untersucht und ihre Messgenauigkeiten verglichen.

Die Ergebnisse der Prüfung der Kaliumpermanganat (KMnO4)-Konzentration in der Küvette. (a) Absorptionsmodus, (b) Transmissionsmodus und (c) 0,01 M Fluorescein für den Fluoreszenzmodus (d) Analysegenauigkeit der Küvette für Kaliumpermanganat im Absorptionsmodus.

Die Ergebnisse der Prüfung der Kaliumpermanganat (KMnO4)-Konzentration im Mikrofluidikgerät. (a) Absorptionsmodus, (b) Transmissionsmodus und (c) 0,01 M Fluorescein für den Fluoreszenzmodus. (d) Analytische Genauigkeit eines Mikrofluidikchips für Kaliumpermanganat im Absorptionsmodus.

Zur Untersuchung der Milchqualitätsergebnisse wurde die optische Photospektrometertechnik eingesetzt. Diese Technik analysiert die Absorption, Transmission und Fluoreszenz einer Lösung, wodurch ihre Eigenschaften bestimmt werden können. Der Test wurde unter Verwendung von Kaliumpermanganat als Standardsubstanz für den Absorptions- und Transmissionsmodus durchgeführt, um die Funktionalität der Küvette und des Mikrofluidikchips zu demonstrieren. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen dargestellt. 6a,b bzw. 7a,b. Kaliumpermanganat, das eine spektrale maximale Wellenlänge von 525 nm aufweist, wurde verwendet, um die Fähigkeit des Geräts zu bestimmen, eine Analyse im Absorptions- und Transmissionsmodus durchzuführen. Im Fluoreszenzmodus wurde der Test mit einer Standardsubstanz 0,01 M Fluorescein durchgeführt, um die Funktionalität der Küvette und des Mikrofluidikchips zu demonstrieren. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen dargestellt. 6c und 7c. Fluorescein, das eine spektrale maximale Wellenlänge von 518 nm aufweist, wurde verwendet, um die Fähigkeit des Geräts zu bestimmen, eine Analyse im Fluoreszenzmodus durchzuführen.

Darüber hinaus führten wir eine Analyse durch, um die Genauigkeit des Mikrofluidikgeräts im Absorptionsmodus im Vergleich zur Küvette zu bewerten, wie in den Abbildungen dargestellt. 6d und 7d. Die Ergebnisse zeigten, dass das Mikrofluidikgerät einen zuverlässigen R-Quadrat-Wert von 0,9642 aufwies, während die Küvette einen R-Quadrat-Wert von 0,9877 aufwies, mit einer Varianzdifferenz von nur 0,0235. Dieses Experiment zeigt, dass das mikrofluidische Gerät spektroskopisch getestet werden kann und eine Genauigkeit liefert, die mit der des Standardküvettenhalters vergleichbar ist.

Das anschließende Experiment umfasste das Testen von Milch in einem Mikrofluidik-Chip, wobei die Tests im Absorptions-, Transmissions- und Fluoreszenzmodus durchgeführt wurden. Die Absorptions- und Übertragungsmodi wurden mit einer Standardlösung von Kaliumpermanganat im Vergleich zu Milch getestet. Die Testergebnisse sind in Abb. 8a und b dargestellt. Es wurde festgestellt, dass der Küvettentest nicht in der Lage war, Milch über Absorptions- und Transmissionsmodi zu messen, obwohl solche Modi für Kaliumpermanganat möglich waren. In der Zwischenzeit wurde der Fluoreszenzmodus mit Fluorescein, OA und mit AO gemischter Milch getestet; Die Testergebnisse sind in Abb. 8c dargestellt. Dies zeigt, dass das Mikrofluidikgerät in der Lage ist, Unterschiede in der Milch zu erkennen. Darüber hinaus wurde es mit der Küvette verglichen. Die Ergebnisse sind in Abb. 8d dargestellt und zeigen, dass die Küvette die Unterschiede nicht analysieren konnte. Dieses Experiment zeigt somit, dass der Mikrofluidikchip Milch im Fluoreszenzmodus analysieren kann.

Die Testmilch und KMnO4 im Mikrofluidikchip (a) Absorptionsmodus und (b) Transmissionsmodus. (c) Testen von 0,01 M Fluorescein, AO und einer Mischung aus Milch und AO im Mikrofluidik-Chip-Fluoreszenzmodus. (d) Testen von 0,01 M Fluorescein, AO und einer Mischung aus Milch und AO in der Standardausrüstung (Küvette). (e) Vergleich der Genauigkeit unter einem Mikrofluidikgerät und einem fossomatischen Zellzählgerät. Die rote Linie zeigt die klinische Milch, die gelbe Linie zeigt die subklinische Milch und die grüne Linie zeigt die normale Milch.

Um die Leistung des Mikrofluidikgeräts im Vergleich zu den CMT- und Fossomatic-Referenzergebnissen zu bewerten, wurde ein Abschlusstest durchgeführt. Das für Rohmilch konzipierte Mikrofluidikgerät wurde mit einem Mini-Photospektrometer analysiert. Für dieses Experiment wurde angenommen, dass es sich bei den somatischen Messungen um Messungen auf Zellebene handelte. Sowohl die CMT-Methode als auch die reguläre Methode zur Analyse abnormaler Rohmilch zeigten das Vorhandensein somatischer Zellen in der Milch. Das CMT-Reagenz reagierte mit der Rohmilch, was zum Abbau hämatopoetischer Zellen führte, was zu dicker und zähflüssiger Milch führte. Das Fossomatic-Instrument nutzte das FCM-Messprinzip, das ein Durchfluss- und Farbstoffmischsystem nutzte, um eine zellenweise Messung zu ermöglichen. Um Attribute auf Zellebene optisch zu messen, mussten die Messungen der Küvette auf eine Größe verkleinert werden, die näher an der der somatischen Zellen liegt. Um dies zu erreichen, wurde ein Mikrofluidiksystem entwickelt, um eine Gruppe von Zellen in einen Strahlinspektionsbereich zu transportieren, dessen Größe der der Zellen ähnelt. Abschließend wurden die Körperzellen in den Analysebereich transportiert, wo die Ergebnisse mit einem Minispektrometer analysiert wurden. Die Milchanalyse wurde für die Lichtabsorptions-, Transmissions- und Fluoreszenzmodi entwickelt. Abbildung 8e zeigt die Analyseergebnisse, die mit der Genauigkeit der mit dem Fossomatic-Gerät durchgeführten Analyse verglichen wurden und eine Genauigkeit von bis zu 95 % ergaben, wie in Tabelle 2 dargestellt.

Allerdings hatten die Komponenten des entworfenen Chips noch einige Nachteile. Obwohl der Mikrofilter somatische Zellen mit einer Größe von weniger als 50 µm filtern konnte und nur diese Zellen durch den Mischabschnitt passieren ließ, verringerten größere Partikel, die zu Beginn blockiert waren, die Durchflussrate und könnten ein Ungleichgewicht in der Konzentration zwischen den Zellen verursacht haben Probe und Farbstoff. Die anfänglich blockierten großen Partikel können die Durchflussrate verringern und zu einer ungleichmäßigen Konzentration zwischen Probe und Farbstoff führen. Darüber hinaus führt die Verstopfung dazu, dass das Mikrofluidgerät nach 10 Minuten verstopft ist, was bedeutet, dass es nur noch weniger als 10 Minuten lang verwendet werden kann. Die Forscher planen, diese Nachteile zu überwinden, indem sie ein Entfernungssystem für somatische Zellen entwickeln, die größer als 50 µm sind, um die oben genannten Probleme zu vermeiden.

Es wurde ein analytisches Mikrofluidikgerät entwickelt und hergestellt, das das Prinzip eines Minispektrometers nutzt, um eine hohe somatische Zellzahl in Milch zu erkennen. Das mikrofluidische Gerät kann Anomalien in den Fluoreszenzmodi analysieren und so Milchinfektionen anhand verschiedener Spektralkurven charakterisieren. Die Fluoreszenzstärke der infizierten Milch mit hohen somatischen Zellen war höher als die von normaler Milch ohne somatische Zellen. Die experimentellen Ergebnisse des Mikrofluidikgeräts stimmten mit denen des Standard-Fossomatic-Geräts überein und bestätigten die Genauigkeit der Messungen mit einer Genauigkeit von bis zu 95 %. Daher konnte das mikrofluidische Gerät Mastitistrends bei Kühen erkennen, die mit denen des Fossomatic-Geräts vergleichbar sind. Diese Ergebnisse können bei der Entwicklung eines Prototyps eines Geräts genutzt werden, mit dem das Vorhandensein von Mastitis innerhalb des Spektrums erkannt werden kann.

Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind aufgrund der Auswirkungen auf die Kuhmilchindustrie in unserem Land nicht öffentlich verfügbar, können aber auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor angefordert werden.

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Trisadee Khamlor

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CP, KL und RP sind die Hauptforscher und haben das Hauptmanuskript geschrieben. WN und TK ist der Unterstützer und Analyseberater der Einrichtung.

Korrespondenz mit Komgrit Leksakul.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 06. Dezember 2022

Angenommen: 10. April 2023

Veröffentlicht: 13. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33258-0

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