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Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 10093 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die entscheidende Biologie, die neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) von anderen Formen des Zelltods unterscheidet, ist ungeklärt, und Techniken zur eindeutigen Identifizierung von NETs sind weiterhin schwer fassbar. Die Messung der Raman-Streuung bietet einen ganzheitlichen Überblick über die molekulare Zusammensetzung der Zelle auf der Grundlage charakteristischer Bindungsschwingungen in Komponenten wie Lipiden und Proteinen. Wir haben Raman-Spektren von NETs gesammelt und nekrotische Zellen eingefroren/aufgetaut, indem wir eine speziell angefertigte Hochdurchsatzplattform verwendet haben, die in der Lage ist, Spektren einzelner Zellen schnell zu messen. Die Hauptkomponentenanalyse der Raman-Spektren von NETs unterschied sie trotz ihrer ähnlichen Morphologie deutlich von nekrotischen Zellen und demonstrierte ihre grundlegenden molekularen Unterschiede. Im Gegensatz dazu konnten klassische Techniken zur NET-Analyse, Immunfluoreszenzmikroskopie, extrazelluläre DNA und ELISA diese Zellen nicht differenzieren. Darüber hinaus zeigte die maschinelle Lernanalyse von Raman-Spektren subtile Unterschiede zwischen Lipopolysaccharid (LPS)-induzierten und Phorbolmyristatacetat (PMA)-induzierten NETs, ​​was zeigt, dass die molekulare Zusammensetzung von NETs je nach verwendetem Stimulans variiert. Diese Studie zeigt die Vorteile der Raman-Mikroskopie bei der Unterscheidung von NETs von anderen Arten des Zelltods und anhand ihres Induktionswegs.

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind eine Form des Zelltods, die durch den Zerfall des Zellkerns und die Freisetzung von DNA in einer wolken- oder fadenähnlichen Struktur gekennzeichnet ist1,2. Aufgrund ihrer heiklen und vielfältigen Natur war die Entwicklung spezifischer und unkomplizierter Techniken zur Charakterisierung von NETs schwierig3,4. Obwohl zahlreiche Forschungsarbeiten gezeigt haben, dass die NET-Bildung eine kontrollierte und eigenständige Form des Zelltods ist2,5, gibt es erhebliche Überschneidungen mit anderen Zelltodwegen, und die genaue Definition von NETs ist umstritten4. Die DNA-Dekondensation und -Freisetzung unterscheidet NETs von Prozessen wie Apoptose, Nekroptose und Pyroptose, die alle zur Kernkondensation führen6,7. Spätere Stadien vieler Zelltodwege können jedoch zum Zellkernzerfall und zur DNA-Freisetzung führen, was die Endpunktanalyse möglicherweise verwirren kann. Beispielsweise führt eine sekundäre Nekrose, die nach der Apoptose auftritt, zur DNA-Dekondensation, Zelllyse und Freisetzung extrazellulärer Inhalte8,9,10. Darüber hinaus kann ein nicht regulierter Zelltod, wie z. B. Nekrose, die direkt durch physiologische Zellschäden verursacht wird, zu Merkmalen führen, die der NET-Bildung bemerkenswert ähnlich sind11,12. Es ist wichtig, diese Arten des Zelltods zu unterscheiden, um zu verstehen, welche Wege aktiviert werden, um den Zelltod zu verursachen, wie sie kontrolliert werden können, um mögliche pathologische Folgen zu mildern, und ob der Zelltod das Ergebnis physiologischer Beeinträchtigungen oder von Stress für die Zellen währenddessen ist experimentellen Verfahren oder handelt es sich um einen echten programmierten Zelltodweg6.

Der Nachweis und die Quantifizierung von NET beruht in der Regel auf einer Kombination aus extrazellulärer DNA-Messung, Zellmorphologie und Proteinmarkern. Die häufigsten sind Myeloperoxidase (MPO), neutrophile Elastase (NE) und citrullinierte Histone. Bei der extrazellulären DNA-Messung werden Fluoreszenzfarbstoffe wie PicoGreen2 verwendet, um die in den Überstand freigesetzte DNA zu messen. Undurchlässige DNA-Farbstoffe wie Sytox Green werden häufig auch zum Färben von NETs verwendet, wobei Zellen mit einer intakten Membran ausgeschlossen werden, was eine Quantifizierung durch Techniken wie Durchflusszytometrie ermöglicht13,14,15. Obwohl diese Techniken einfach zu implementieren sind, sind sie aufgrund ihrer Unfähigkeit, NETs von anderen Formen des Zelltods zu unterscheiden, begrenzt. Die Morphologieanalyse ist hier eine Verbesserung, erfordert jedoch eine Bildgebung mit anschließender manueller Zählung oder automatisierter Bildverarbeitung16,17,18,19,20. Dies kann mühsam sein und zu Verzerrungen führen. Daher werden häufig Proteinmarker eingeführt, um die Genauigkeit zu verbessern. Neben unterstützenden bildgebenden Verfahren werden Proteinmarker in Sandwich-ELISAs eingesetzt, bei denen NETs mithilfe von Proteinantikörpern, üblicherweise Anti-MPO, immobilisiert und über Antikörper gegen DNA (oder umgekehrt) nachgewiesen werden21,22,23.

Eine Alternative zur Verwendung einzelner, gezielter Proteinmarker für die Zellanalyse ist eine unbeaufsichtigte Abfrage des gesamten molekularen Inhalts der Zelle. Dadurch können tiefere Ebenen der Charakterisierung erreicht und bisher nicht berücksichtigte Unterscheidungsmerkmale sichtbar gemacht werden. Die Raman-Spektroskopie erkennt Laserstreumuster, die durch Schwingungen molekularer Bindungen erzeugt werden, wobei jüngste Fortschritte in der markierungsfreien Raman-Spektralmikroskopie die Abfrage des Molekülinhalts mit Einzelzellauflösung in lebenden Zellkulturen ermöglichen24,25. Die durch Raman erzeugten komplexen Daten auf hoher Ebene erfordern entsprechende Analysetechniken, wie z. B. Dimensionsreduktion durch Hauptkomponentenanalyse (PCA) oder maschinelles Lernen, um kritische spektrale Unterschiede zwischen komplexen Proben zu identifizieren. Auf diese Weise kann Raman zur Klassifizierung von Zellzuständen wie aktivierten gegenüber ruhenden Makrophagen24 oder Zelltypen wie residenten gegenüber infiltrierenden Makrophagen26 und krebsartigen gegenüber gesunden Zellen27 verwendet werden; ohne dass spezifische Proteinmarker erforderlich sind. Die Raman-Spektroskopie findet bei der Untersuchung von Neutrophilen, die kleiner sind und deren Messung schwieriger sein kann, weniger Anwendung. Dennoch wurde über einige wichtige Demonstrationen der Leistungsfähigkeit der Raman-basierten Analyse berichtet: Hochdurchsatz-Screening verschiedener weißer Blutkörperchen, einschließlich Neutrophilen28, mit Berichterstattung über die Leukozyten-Subtypisierung29. Die Aktivierung von Neutrophilen30,31 und die Differenzierung32 wurden ebenfalls durch Raman-Analyse verfolgt. Neben der Phänotypisierung und Charakterisierung von Zellzuständen kann die Raman-Spektroskopie auch Aufschluss über spezifischere molekulare Funktionen in Neutrophilen geben, beispielsweise über Lipidkörper-Assoziationen mit der Zellfunktion33.

In dieser Studie verwendeten wir Gefrier-/Tau-Nekrose, die zu einer NET-ähnlichen Morphologie führte, als Grundlage, um die Fähigkeit der Raman-Mikroskopie zu testen, NETs von nekrotischen Zellen zu unterscheiden. Obwohl herkömmliche Techniken nicht in der Lage sind, diese Zellen zu unterscheiden, zeigen wir deutliche spektroskopische Unterschiede im Raman-Signal, was auf molekulare Unterschiede auf grundlegender Ebene bei diesen Zelltypen hinweist. Wir verwenden PCA, um die wichtigsten Raman-Merkmale einzugrenzen, die diese Zelltypen unterscheiden und eine Klassifizierung ermöglichen. Wir führen außerdem Analysen durch, die auf logistischer Regression basierendes maschinelles Lernen nutzen, um zu zeigen, dass durch verschiedene Reize erzeugte NETs anhand ihres Raman-spektroskopischen Fingerabdrucks unterschieden werden können. Insgesamt bieten wir ein tieferes Verständnis der Unterschiede zwischen Nekrose und verschiedenen Arten der NET-Bildung und heben molekulare Unterschiede hervor, die durch Raman-Mikroskopie eindeutig identifiziert werden können, und bieten damit einen wichtigen Ansatz für die NET-Analyse.

Wir untersuchten zunächst die Fähigkeit herkömmlicher Techniken, NETs von nekrotischen Neutrophilen zu unterscheiden. Wir induzierten NETs unter Verwendung von zwei Modellstimuli, Phorbolmyristatacetat (PMA) und Lipopolysaccharid (LPS), während wir zur Induktion der Nekrose eine Runde Einfrieren/Auftauen bei –80 °C verwendeten, was unserer Meinung nach nekrotische Zellen erzeugte, die im Aussehen NETs ähnelten. Wir analysierten Zellen mithilfe von Immunfluoreszenzmikroskopie, PicoGreen-DNA-Quantifizierung und DNA/MPO-Komplex-ELISA gemäß weit verbreiteten Protokollen.

Für die Immunfluoreszenzmikroskopie verwendeten wir durchlässige und undurchlässige DNA-Farbstoffe Hoechst und Sytox Green, kombiniert mit einem fluoreszierenden Anti-MPO-Antikörper (Abb. 1A). NETs präsentierten sich als große, diffuse, wolkenartige DNA-Strukturen, die zusammen mit der MPO-Färbung lokalisiert wurden, ohne dass sofort Unterschiede zwischen PMA- und LPS-induzierten NETs erkennbar waren. Nekrotische Zellen zeigten eine ähnliche wolkenartige DNA-Morphologie, und entscheidend ist, dass nekrotische Zellen auch stark mit MPO gefärbt wurden, das zusammen mit DNA lokalisiert war. Eine Isotypkontrolle für den verwendeten MPO-Antikörper ergab ein geringes Signal, was darauf hindeutet, dass eine unspezifische Adsorption des Antikörpers unwahrscheinlich ist (Supp Abb. 1A). Die automatisierte Maskierung und Quantifizierung der Zellfläche sowie der Intensität der Sytox Green- und MPO-Färbung (Zellmerkmale, die häufig für die NET-Analyse verwendet werden) zeigte, dass es zwar signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen gab, diese Merkmale jedoch zwischen NETs und nekrotischen Zellen weitgehend überlappten (Supp Abb. 2). .

Einschränkungen der DNA-Morphologie und einzelner Proteinmarker-Ansätze bei der Unterscheidung von Nekrose und NET-Bildung. Repräsentative Bilder von scheinbehandelten Neutrophilen, LPS-induzierten NETs (10 μg/ml), PMA-induzierten NETs (100 nM) und nekrotischen Zellen (Einfrieren/Auftauen), gefärbt mit Hoechst (Cyan), Sytox Green (SYG, Grün), und PE-konjugierter Anti-Myeloperoxidase-Antikörper (MPO, rot) nach 4-stündiger Inkubation bei 37 °C, direkt in Plattenvertiefungen ohne Waschen abgebildet (A). Beachten Sie, dass die Hoechst-Intensität für die Visualisierung der Scheinprobe optimiert ist, sodass ihr Signal für NETs und nekrotische Zellen, die eine viel geringere DNA-Dichte haben, nicht wahrnehmbar ist. Der Maßstabsbalken beträgt 25 μm. Die durch anfängliches Waschen und anschließendes Abheben von der Oberfläche durch teilweisen Nukleaseverdau gesammelte DNA wurde durch PicoGreen-Fluoreszenz für die Gesamt-DNA (B) und durch Anti-MPO-Capture-Anti-DNA-Detektions-ELISA für MPO/DNA-Komplexe (C) quantifiziert. Datenpunkte repräsentieren unabhängige Experimente an verschiedenen Tagen mit unterschiedlichen Spendern. ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05, bestimmt durch ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test.

Als nächstes verwendeten wir die PicoGreen-Fluoreszenz, einen Indikator für die NET-Bildung, der auf der Freisetzung extrazellulärer DNA basiert. Dieser Test kann mit DNA durchgeführt werden, die direkt in den Überstand freigesetzt wird, oder mit DNA, die nach Rühren und/oder teilweisem Nukleaseverdau von der Oberfläche freigesetzt wird. Vorläufige Experimente zeigten, dass eine teilweise Verdauung mit Mikrokokken-Nuklease die konsistentesten Ergebnisse lieferte, weshalb wir diesen Ansatz gewählt haben. Wie aus der PicoGreen-Fluoreszenzintensität hervorgeht, führten Nekrose und beide Arten der NET-Induktion zu einer robusten Freisetzung von DNA im Vergleich zur Schein-DNA, es gab jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den behandelten Gruppen (Abb. 1B). Dies weist darauf hin, dass DNA aus Gefrier-/Tau-Nekrose beim Waschen an der Oberfläche haften bleibt und durch Nuklease-Verdau auf ähnliche Weise wie bei NETs freigesetzt wird.

Abschließend analysierten wir die Proben mittels DNA/MPO-Komplex-ELISA. Dieser Ansatz ähnelt dem PicoGreen-Ansatz, wird jedoch im Allgemeinen als spezifischerer Marker für die NET-Bildung angesehen, da nur DNA/MPO-Komplexe und nicht die gesamte DNA gemessen werden. Trotzdem produzierten nekrotische Zellen und NETs äquivalente Mengen an DNA/MPO-Komplexen (Abb. 1C). Um einer möglichen unspezifischen Adsorption entgegenzuwirken, wurde anstelle des Anti-MPO-Einfangantikörpers eine Isotypkontrolle verwendet, es wurde jedoch kein nennenswertes Signal festgestellt (Supp Abb. 1B). Insgesamt zeigen wir, dass die Unterscheidung von NETs von nekrotischen Gefrier-/Tauzellen mit herkömmlichen Techniken problematisch ist.

Wie oben gezeigt, haben wir gezeigt, dass die Identifizierung von NETs anhand der DNA-Morphologie oder eines einzelnen Proteinmarkers eine Herausforderung sein kann. Ein alternativer Ansatz besteht darin, eine umfassende Untersuchung der molekularen Zellmerkmale durchzuführen, was wir mithilfe der Raman-Mikroskopie erreicht haben. NETs und nekrotische Zellen wurden auf die gleiche Weise wie oben induziert. Die Zellen wurden mithilfe einer speziell angefertigten optischen Plattform abgefragt, die Fluoreszenz- und Raman-Spektroskopie kombinierte, wie wir zuvor beschrieben haben24 (Abb. 2). Aufgrund ihres begrenzten Hellfeldkontrasts war es nicht möglich, die Position unmarkierter NETs zu identifizieren, und daher war es notwendig, einen DNA-Fluoreszenzmarker, Helix NP Blue, einzubeziehen, von dem wir bestätigten, dass er das Raman-Signal nicht störte (Supp Abb. 3). NETs und nekrotische Zellen wurden anhand einer großen Fläche und eines Helix NP Blue-Signals geringer Intensität identifiziert, was auf eine für NETs typische diffuse DNA-Wolke hinweist.

Einzelzell-Raman-Messungen von NETs und Einfrieren/Auftauen nekrotischer Zellen mithilfe einer multimodalen optischen Plattform. Mit dem Fluoreszenzmarker Helix NP Blue werden Zellen räumlich lokalisiert. Der Maßstabsbalken beträgt 25 μm. Dann werden Kippspiegel verwendet und ein Laser wird mithilfe von Hybrid-Scanning-Spiegeln schnell über den zentralen Bereich einer einzelnen Zelle bewegt, von dem das Raman-Streuungsspektrum erfasst wird.

Die durchschnittlichen Raman-Spektren, grundlinienkorrigiert durch kubischen Spline, werden für jede Behandlungsgruppe angezeigt (Abb. 3A, B). Aufgrund der Basislinienkorrektur erscheinen einige Teile der Spektren negativ, die Peakpositionen und -stärken sind jedoch in allen Datensätzen vergleichbar. Die resultierenden Spektren sind typisch für lebende Immunzellen, wobei die Spektren hauptsächlich aus protein- und lipidbezogenen Banden bestehen, mit einigen kleineren Beiträgen anderer zellulärer Moleküle wie DNA und RNA. Weitere Einzelheiten zu den Ursprüngen dieser Banden sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die durchschnittlichen Raman-Spektren der LPS- und PMA-induzierten NETs sind nahezu identisch und zeigen einen deutlichen Verlust an biologischem Inhalt im Vergleich zu unbehandelten Zellen, während das durchschnittliche Raman-Spektrum der nekrotischen Neutrophilen zeigt ebenfalls einen bemerkenswerten Verlust des biologischen Inhalts, wenn auch nicht so schwerwiegend (Abb. 3A, B). Zu den Hauptunterschieden zwischen nekrotischen Zellen und NETs gehören eine Verringerung des Beitrags des Quarzsubstrats sowie erhöhte Protein- und Lipidbeiträge. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Neutrophile bei der Bildung von NETs einen dramatischen Verlust an Zellinhalt erleiden, wobei das verbleibende Material überwiegend proteinbasiert zu den Raman-Spektren beiträgt. Nekrotische Zellen verlieren ebenfalls einen erheblichen Teil des Materials, das zu ihren Raman-Spektren beiträgt, scheinen aber einen größeren Teil ihres Lipidgehalts zu behalten.

Die Hauptkomponentenanalyse der Raman-spektrografischen Merkmale verdeutlicht die großen molekularen Unterschiede zwischen nekrotischen Zellen und NETs. Durchschnittliche, grundlinienkorrigierte Einzelzell-Raman-Spektren für jede Behandlungsgruppe, separat dargestellt mit der Standardabweichung, dargestellt durch den schattierten Bereich (A), oder überlagert auf einem Diagramm (B). Punktediagramm (C), durch jede Komponente erklärte Varianz (D) und Belastungsvektor für PC1 (E) für die Hauptkomponentenanalyse (PCA) von LPS-, PMA- und nekrotischen Zell-Raman-Spektren.

Um die Hauptbeiträge zur Varianz im Datensatz zu untersuchen, führten wir eine PCA von Raman-Spektren durch, die aus nekrotischen Zellen und NETs gewonnen wurden. Die größte Varianz im Datensatz (PC1, 57 %) teilt die Daten in zwei klar getrennte Populationen auf, die aus nekrotischen Zellen mit größtenteils positiven PC1-Werten und NETs bestehen, was negative Werte ergibt (Abb. 3C, D). Der Ladevektor für PC1 ist dargestellt (Abb. 3E), wobei mögliche spektrale Beiträge in Tabelle 1 zusammengefasst sind. Insgesamt haben LPS- und PMA-induzierte NETs im Vergleich zu nekrotischen Zellen größere Beiträge von Quarz sowie vom Proteinrückgrat (Bande bei ~ 1049 cm−1)34 und H-C=C-Schwingungen (Bande bei ~ 3003 cm−1)35, was darauf hindeutet, dass ungesättigte Fettsäureketten vorhanden sind, sind stärker mit NETs verbunden.

Um die Unterschiede zwischen LPS- und PMA-induzierten NETs gezielt zu untersuchen, wurde eine zweite PCA durchgeführt, wobei die nekrotischen Daten ausgeschlossen wurden. Während die Diagramme der PC-Scores zeigen, dass es schwierig ist, die beiden Behandlungstypen zu trennen, bestehen einige kleine Unterschiede bei PC1, PC2 und PC5 (Abb. 4A, B). Um die Trennschärfe zwischen den Behandlungsgruppen für jeden PC zu berechnen, haben wir F- berechnet. Werte unter Verwendung der ANOVA wie zuvor beschrieben26 (Abb. 4C). PC1 war am höchsten, was darauf hindeutet, dass dieser PC insgesamt die beste Trennung der beiden Behandlungsgruppen bietet. PC7 und PC10 zeigten die nächsthöheren F-Werte und wir haben diese gegen PC1 aufgetragen (Supp Abb. 4), allerdings waren diese PCs zwischen den beiden Gruppen sehr ähnlich und ihre Belastungsvektoren waren biologisch nicht aussagekräftig (Supp Abb. 5). Ladevektoren für die PCs, die die meisten Varianz- und Populationsunterschiede erklären, PC1, PC2, PC5, sind dargestellt (Abb. 4D), wobei die Bandbeiträge in Tabelle 1 zusammengefasst sind. Aufgrund der spektralen Ähnlichkeit zwischen LPS- und PMA-NETs, ​​PCA, insgesamt war nicht in der Lage, zwischen den beiden Populationen zu unterscheiden.

Die Hauptkomponentenanalyse konnte PMA- und LPS-induzierte NETs nicht unterscheiden. Ergebnisdarstellung (A) und erklärter Varianz durch jede Komponente (B) für die Hauptkomponentenanalyse (PCA) von LPS- und PMA-induzierten NETs-Raman-Spektren. Konturlinien stellen das 50. und 90. Perzentil des Datensatzes dar, mit N = 1332 NETs aus LPS und N = 1458 NETs aus PMA-behandelten Zellen. F-Testwerte pro Behandlungsgruppe, die die Trennleistung für jeden PC angeben (C). Laden von Vektoren für PC1, PC2, PC5, wobei andere PCs in der ergänzenden Abbildung 4 dargestellt sind.

Um festzustellen, ob es feine molekulare Unterschiede zwischen LPS- und PMA-induzierten NETs gibt, die in den Raman-Spektren erkannt wurden, die nicht in der PCA-Analyse erfasst wurden, verwendeten wir überwachtes maschinelles Lernen auf der Grundlage eines bestraften logistischen Regressionsmodells24,26. Diese Methode verwendet die grundlinienkorrigierten Spektren, jedoch keine PCA-verarbeiteten Spektren. Es wird versucht, nur die nützlichsten Spektralparameter basierend auf der Genauigkeit der Klassifizierung mithilfe eines gekennzeichneten Trainingsdatensatzes zu identifizieren. Parameter, die die Klassifizierungsgenauigkeit nicht wesentlich verbessern, werden mithilfe des Lasso-Ansatzes entfernt, der diese Parameter durch die Einführung eines Strafterms in den Algorithmus auf Null reduziert.

Die Daten wurden nach dem Zufallsprinzip in einen Trainingssatz aufgeteilt, der aus 80 % der Proben besteht, in denen dem Modell Behandlungsgruppeninformationen zur Verfügung gestellt werden, und einen Testsatz, der die restlichen 20 % enthält, aus denen das Modell versucht, Proben zu klassifizieren, ohne vorher über ihre Behandlung Bescheid zu wissen. Das Modell identifizierte 77 % bzw. 87 % der LPS- bzw. PMA-induzierten NETs im Testdatensatz genau (Abb. 5A–C), was darauf hinweist, dass subtile, aber konsistente molekulare Unterschiede zwischen NETs bestehen und dass diese Unterschiede zuverlässig erkannt werden können unsere Raman-Messungen. Die im Modell verwendeten Spektralmerkmale werden durch den Trennungsvektor dargestellt (Abb. 5D). Trotz der Versuche des Modells, eine Parameterreduktion durchzuführen, bleibt der Trennungsvektor äußerst komplex und schwer zu interpretieren. Dies weist darauf hin, dass die Klassifizierung einen großen Satz molekularer Informationen erfordert, um die konsistenten Unterschiede in den beiden Behandlungsgruppen herauszufinden. Insgesamt zeigen wir, dass es trotz sehr ähnlicher Spektren bei LPS- und PMA-induzierten NETs dennoch komplexe, kleine Unterschiede zwischen diesen Behandlungsgruppen gibt, die durch eine Feinabstimmung der Klassifizierung durch überwachtes maschinelles Lernen erfasst werden können.

Maschinelles Lernen deckt molekulare Unterschiede auf, die PMA- und LPS-induzierte NETs unterscheiden. Wahrscheinlichkeitswerte für jede Zelle im Trainings- und Testdatensatz (A). Verwirrungsmatrizen zeigen die Vorhersagegenauigkeit (B) und ROC-Kurve zeigt die Spezifität und Sensitivität des Modells (C). Für die Klassifizierung verwendeter Trennungsvektor (D). Für den Trainingsdatensatz ist N = 1060 für LPS-behandelt und N = 1172 für PMA-behandelt. Für den Testdatensatz war N = 272 für LPS-behandelt und N = 286 für PMA-behandelt.

Der Bedarf an Techniken, die NETs eindeutig von anderen Formen des Zelltods unterscheiden, wurde in einem kürzlich durchgeführten Panel-Review als eines von vier Schlüsselthemen in der NET-Forschung aufgeführt4. Diese Studie unterstreicht den Nutzen der Raman-Mikroskopie bei der Unterscheidung molekularer Unterschiede zwischen NETs und nekrotischen Zellen sowie zwischen NETs, ​​die durch verschiedene Reize erzeugt werden. Wir zeigen, dass diese subtilen Unterschiede mit herkömmlichen Methoden wie Immunfluoreszenzmikroskopie oder ELISA schwer zu erkennen sein können, und betonen die Einschränkungen der Verwendung ausgewählter Biomarker für die NET-Quantifizierung sowie die Vorteile eines ganzheitlichen Ansatzes wie der Raman-Mikroskopie.

Bevor wir einen Raman-Ansatz anwendeten, testeten wir die Fähigkeit von drei gängigen Techniken, NETs von nekrotischen Zellen zu unterscheiden: DNA-Quantifizierung mit PicoGreen, MPO/DNA-ELISA und Immunfluoreszenzmikroskopie. Standardprotokolle für PicoGreen- und MPO-ELISA-Assays umfassen einen ersten Waschschritt, um abgebaute und nekrotische DNA zu entfernen, gefolgt von einem teilweisen Nukleaseverdau, um die am Substrat haftende NET-DNA freizusetzen22. Wir folgten diesem Protokoll, führten jedoch im Vergleich zur NET-Bildung durch grundlegendes Einfrieren/Auftauen zu ähnlichen Mengen an DNA, die auf dem Substrat zurückblieben und während des Nukleaseverdaus freigesetzt wurden. Wichtig ist, dass dies für DNA zutraf, die direkt durch PicoGreen-Fluoreszenz oder im Komplex mit MPO nachgewiesen und durch ELISA nachgewiesen wurde. Interessanterweise wurden die DNA-Bindungseigenschaften von MPO beschrieben36, und es erscheint plausibel, dass MPO auf natürliche Weise einen Komplex mit DNA bildet, wenn diese Moleküle in Kontakt kommen. Dies wird unterstützt, wenn die direkte Zerstörung neutrophiler Zellmembranen durch Elektropermeabilisierung zur Freisetzung von MPO in einem Komplex mit DNA führt, der NETs ähnelt12. Im Gegensatz dazu deuten andere Studien darauf hin, dass durch TNF-α21,23 induzierte apoptotische Neutrophile und durch Ultraschall21 induzierte nekrotische Neutrophile nicht zu einer messbaren MPO/DNA-Komplexbildung führen. Ein Grund dafür könnte sein, dass diese Formen des Zelltods keine nennenswerten Mengen an DNA außerhalb der Zelle freisetzen oder dass im Falle der Ultraschallbehandlung möglicherweise DNA/MPO-Komplexe zerstört werden. Eine weitere plausible Erklärung ist, dass in unserem Protokoll nekrotische Zellen 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert wurden (die gleiche Zeit wie die NET-Induktion) und dass diese Zeit möglicherweise erforderlich ist, damit MPO einen Komplex mit DNA bildet.

Wir untersuchten Zellen auch mittels Immunfluoreszenzmikroskopie. Während die Morphologie und Färbeintensität von nekrotischen Zellen und NETs ziemlich ähnlich waren, einschließlich der Färbung mit fluoreszierendem MPO-Antikörper, gab es subtile Unterschiede, die beim Vergleich nebeneinander erkannt werden konnten. Während diese durchaus zur genauen Unterscheidung von NETs verwendet werden könnten, wären sie anfällig für Verzerrungen und Schwankungen bei der Probenvorbereitung4,37 und aktuelle automatisierte Techniken, die weitgehend auf der Größe und dem Ausmaß der Sytox-Grün-Färbung basieren, wären wahrscheinlich nicht ausgereift genug, um Zellen auf dieser Grundlage zu klassifizieren diese Unterschiede17,18,38,39,40. Deep-Learning-Algorithmen sind in der Lage, subtile Bildunterschiede zu klassifizieren, um Zellen zu klassifizieren, und konnten erfolgreich eingefrorene/auftauende nekrotische Zellen, ähnlich den hier vorgestellten, von NETs unterscheiden11. Diese Modelle befinden sich noch in einem frühen Entwicklungsstadium und basieren auf großen, konsistenten Datensätzen. Angesichts der oben erwähnten Variabilität in der NET-Morphologie bleibt abzuwarten, ob diese als allgemeine Technik zur Quantifizierung von NETs durchführbar sind.

Im Gegensatz zu herkömmlichen Techniken konnten mit der Raman-Mikroskopie deutliche Unterschiede zwischen NETs und nekrotischen Zellen festgestellt werden. Eine einfache PCA-Analyse, die sich nur auf unbeaufsichtigte Weise auf die intrinsische Datenvarianz stützt, konnte diese Zelltypen auf der Grundlage des Raman-Signals in zwei unterschiedliche Populationen aufteilen. Dies ermöglicht die unvoreingenommene und hochspezifische Unterscheidung von NETs und Nekrosen, ohne den Einsatz komplexer Algorithmen, die auf Deep Learning basieren, und ohne auf die Färbung potenziell unspezifischer Proteinmarker angewiesen zu sein. Es ist nicht möglich, die genauen molekularen Unterschiede aus dem komplexen, vermischten Raman-Spektrum jedes Zelltyps zu extrahieren, es können jedoch einige übergreifende Unterschiede untersucht werden. Nekrotische Zellen scheinen im Vergleich zu NETs relativ größere Mengen an Zellmaterial zu enthalten, insbesondere enthalten sie höhere Mengen an Lipiden. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die NET-Bildung zu einem vollständigeren Abbau der Zellmembranen führt, was mit den biologischen Mechanismen übereinstimmt, von denen bekannt ist, dass sie für die NET-Bildung erforderlich sind, wie beispielsweise die Aktivität von Gasdermin D41. Obwohl DNA im Allgemeinen als Hauptbestandteil von NETs gilt, ist die tatsächliche DNA-Dichte deutlich geringer als die in einem Zellkern enthaltene, und letztendlich führt dieser Mangel an Dichte zu einem Raman-Signal unterhalb der Nachweisgrenze in unserem System. Insgesamt ist das von NETs erzeugte Raman-Signal aufgrund ihrer diffusen Natur relativ gering. Dennoch ist unser System in der Lage, deutliche Unterschiede zwischen NETs und eingefrorenen/aufgetauten nekrotischen Zellen zu erkennen, die mit herkömmlichen bildgebenden und biochemischen Methoden schwer zu unterscheiden sind. Um noch einen Schritt weiter zu gehen, war unser System auch in der Lage, NETs anhand ihres Induktionswegs zu unterscheiden.

Durch PMA und LPS induzierte NETs erzeugten deutlich ähnliche Raman-Spektralsignaturen. Die Unterschiede zwischen diesen waren zu gering, um von PCA erfasst zu werden. Ansätze des überwachten Lernens, bei denen Algorithmen darauf ausgerichtet sind, aktiv zwei Klassen zu unterscheiden, bieten einen viel leistungsfähigeren Ansatz zur Klassifizierung von Zelltypen. Unser logistisches Regressionsmodell konnte bei einem Testdatensatz ein hohes Maß an Genauigkeit erreichen, Zellen in etwa 80 % der Fälle korrekt kategorisieren und darauf hinweisen, dass es subtile, aber konsistente biologische Unterschiede zwischen PMA- und LPS-induzierten NETs gibt. In Übereinstimmung damit haben Proteomikstudien von NETs Unterschiede zwischen PMA- und LPS-induzierten NETs gezeigt42. PMA wurde wegen mangelnder biologischer Relevanz kritisiert, und unsere Daten stützen die Annahme, dass sich PMA-NETs messbar von den durch LPS induzierten unterscheiden. Es ist möglich, dass diese Unterschiede die Aktivität von NETs auf andere Zellen und Gewebe beeinflussen.

Eine Einschränkung dieser Studie besteht darin, dass wir nur Daten für Nekrose beim nicht programmierten Zelltod (durch Einfrieren/Auftauen von Zellen) und nicht beim programmierten Zelltod wie Apoptose gesammelt haben. Dafür gab es zwei Gründe. Erstens wollten wir eine Population von Zellen erhalten, die ähnliche Eigenschaften und ein ähnliches Aussehen wie NETs aufwiesen, aber eindeutig keine Art von NET-Formation darstellten. Bei den meisten Arten des programmierten Zelltods handelt es sich um eine Kondensation von DNA und Morphologie, die leicht von NETs unterschieden werden kann, obwohl dies bei sekundärer Nekrose weniger der Fall ist, bei der abgestorbene Zellen beginnen können, sich zu zersetzen und NETs stärker zu ähneln8,9,10. Zweitens werden die genauen Wege und die Definition von NETs immer noch diskutiert4,43 und die Reaktionen von Neutrophilen auf Reize können heterogen sein. Von vielen Arten von Stimulanzien, von denen berichtet wird, dass sie eine bestimmte Art von Zelltod auslösen, wurde auch berichtet, dass sie NETs induzieren. Beispielsweise induziert TNF-α die Apoptose von Neutrophilen44, es wurde jedoch auch berichtet, dass es NETs induziert45. Es ist nicht klar, ob es sich bei den durch TNF-α-Stimulation gemeldeten NETs um apoptotische Zellen handelt, die eine sekundäre Nekrose erlitten haben, oder ob sekundäre Nekrose nach den aktuellen Definitionen als eine Art der NET-Bildung betrachtet werden sollte6.

Insgesamt zeigen wir, dass es mit einem ausreichend empfindlichen System möglich ist, Einzelzell-Raman-Spektren von NETs zu sammeln, die als molekularer Fingerabdruck für jede Zelle dienen können. Diese Sammlung ist minimalinvasiv, erfordert wenig Probenvorbereitung und bietet einen relativ hohen Durchsatz und niedrige Kosten. Im Gegensatz zu klassischen Techniken zur NET-Quantifizierung kann diese Technik nekrotische Zellen leicht von NETs unterscheiden und die klaren molekularen Unterschiede hervorheben, die sich aus dem unterschiedlichen Prozess der NET-Bildung im Gegensatz zum unregulierten Zelltod ergeben. Eine eingehende Untersuchung der komplexen Raman-Informationen, die mithilfe maschinellen Lernens aus Zellen gesammelt werden, kann subtile molekulare Unterschiede in NETs aufdecken, die durch ihren Induktionsweg bestimmt werden. Diese molekularen Signaturunterschiede weisen auf einen grundlegenden Unterschied zwischen diesen NETs hin, der für zukünftige Studien zu nachgelagerten Konsequenzen der NET-Bildung und anderen Bereichen von Bedeutung sein könnte.

Blutproben wurden von drei gesunden Freiwilligen in sieben Experimenten entnommen (zweimal von Spender A, viermal von Spender B und einmal von Spender C), nachdem eine Einverständniserklärung gemäß der Deklaration von Helsinki mit Genehmigung des Ethikprüfungsausschusses von eingeholt worden war der Graduate School of Medicine der Universität Osaka, Japan (Nr. T19204 und Nr. 11122-5). Neutrophile wurden mit dem EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit (Stemcell Technologies, Vancouver, Kanada) isoliert.

Die Experimente wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium durchgeführt: Nährstoffmischung F-12 (DMEM/F12) mit 15 mM HEPES, ohne Phenolrot (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), ergänzt mit 0,005 % menschlichem Serumalbumin (HSA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Um NETs zu induzieren, wurden Neutrophile mit 100 nM PMA oder 10 μg/ml LPS aus Escherichia coli O128:B12 (Sigma-Aldrich) bei 37 °C für 4 Stunden mit 5 % CO2 inkubiert. Beachten Sie, dass die LPS-induzierte NET-Induktion sehr empfindlich auf die HSA-Konzentration reagiert und für den LPS-Stamm und den Inkubationspuffer optimiert werden muss46,47. Zur Nekrose wurden suspendierte Neutrophile bei –80 °C eingefroren, dann bei Raumtemperatur aufgetaut, bevor sie auf Platten oder Schalen verteilt und 4 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert wurden. Der Prozentsatz der NET-Bildung variiert von Spender zu Spender und zwischen den Behandlungen. Für PMA beträgt der NET-Prozentsatz 90–100 %, während er für LPS 30–90 % beträgt. Spektren wurden nur von NETs gesammelt.

Die Immunfluoreszenzmikroskopie wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt48. Die Zellen wurden in mit Gewebekultur behandelten Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen (Thermo Fisher Scientific) mit 6 × 104 Zellen/cm2 ausgesät. Die Zellen wurden mit 0,5 % HSA blockiert, bevor sie mit 4 µM Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich), 500 nM Sytox Green (Thermo Fisher Scientific) und 20 µg/ml PE-konjugiertem Maus-IgG1-Anti-Human-MPO (Klon: MPO-7, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) oder 20 μg/ml PE-konjugierte Maus-IgG1-Isotypkontrolle (Klon: MOPC-21, Biolegend, San Diego, CA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die Bildgebung wurde in den Vertiefungen unter Verwendung eines CQ1-Fluoreszenzmikroskops mit 10-fachem Objektiv (Yokogawa, Tokio, Japan) durchgeführt.

Die Zellen wurden in mit Gewebekultur behandelten Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen mit 3 × 105 Zellen/cm2 ausgesät. Nach der Behandlung wurde der Überstand entfernt und aus den Vertiefungen verworfen, und die Zellen wurden mit 0,5 U/ml Mikrokokken-Nuklease (New England Biolabs, Ipswich, MA) 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Der DNA-Verdau wurde durch die Zugabe von 5 mM EDTA mit einer Endzellkonzentration von 1,4 × 106 Zellen/ml gestoppt. Die Zellen wurden kräftig pipettiert und dann 5 Minuten lang bei 500 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und bei –80 °C eingefroren.

Für den Gesamt-DNA-Assay wurden NET/DNA-Proben mit PicoGreen gefärbt und die Fluoreszenz auf einem GloMax-Mikroplattenlesegerät (Promega, Madison, WI) abgelesen. Der MPO/DNA-ELISA wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt49. Kurz gesagt, Nunc MaxiSorp-Platten mit 96 Vertiefungen und flachem Boden (Thermo Fisher Scientific) wurden mit 5 μg/ml Maus-IgG2b-Anti-Human-MPO (Klon: 4A4, Bio-Rad, Hercules, CA) oder 5 μg/ml Maus-IgG2b-Isotypkontrolle beschichtet (Klon: 27–35, Biolegend) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die restlichen Schritte wurden gemäß dem Roche Cell Death Detection ELISA-Kit (Kat.-Nr. 11544675001, Sigma-Aldrich) durchgeführt.

Die Zellen wurden in 3,5-cm-Quarzbodenschalen (Matsunami Glass, Osaka, Japan) mit 6 × 104 Zellen/cm2 ausgesät. Nach der Behandlung wurden die Zellen 30 Minuten lang mit 1 μM Helix NP™ Blue angefärbt und mit einem 60 × (NA 1,27) Objektiv auf einer benutzerdefinierten optischen Plattform analysiert, die wir zuvor ausführlich beschrieben haben50,51, dargestellt in Abb. 2. Aufgenommene Fluoreszenzbilder Mittels Quecksilberlampenanregung und FITC-Kanal-gefilterter Emission wurden NETs und nekrotische Zellen lokalisiert. Die Raman-Anregung wurde mit einem Dauerstrich-532-nm-Laser (1136 mW/μm2) durchgeführt, wobei rückgestreutes Licht mithilfe eines dichroitischen Spiegels auf ein Spektrometer gerichtet wurde und das Schwingungsspektrum (535–3075 cm−1) mit einer gekühlten Kamera gemessen wurde (Orca 4.0, Hamamatsu, Shizuoka, Japan). Der Fokus wurde entsprechend der Sichtbarkeit der Zellmerkmale auf etwa 2 μm über dem Substrat eingestellt. Die Zellen wurden mittels Hybrid-Scanning abgefragt, bei dem der Laseranregungspunkt schnell auf der vertikalen und horizontalen Achse bewegt wird und einen definierten quadratischen zentralen Bereich jeder Zelle beleuchtet, wobei das Durchschnittssignal erfasst wird. Es wurden Daten für 700–1100 Zellen pro Behandlungsgruppe gesammelt, gepoolt aus sieben unabhängigen Experimenten und drei verschiedenen Spendern.

Die Raman-Daten wurden anhand eines Standard-Ethanol-Spektrums um die täglichen Spektralverschiebungen des Instruments korrigiert, die Basislinie mithilfe eines kubischen Spline korrigiert und der stille Bereich (1800–2700 cm−1) wie zuvor beschrieben entfernt26. Kurz gesagt, PCA, maschinelle Lernanalyse, Darstellung und Statistikberechnungen wurden mit R v3.6.152 durchgeführt. Die Daten wurden standardisiert und die PCA wurde mit der Funktion prcomp durchgeführt und die F-Werte wurden mit ANOVA unter Verwendung des aov-Pakets berechnet. Maschinelles Lernen wurde mithilfe eines bestraften logistischen Regressionsmodells mit Lasso-basierter Parameterreduktion durchgeführt, das mit glmnet53 implementiert wurde, wobei der Bestrafungsterm mithilfe einer zehnfachen Kreuzvalidierung optimiert wurde. Spektren und PC-Diagramme wurden mit den Paketen ggplot254, ggbreak55 und pROC56 erstellt. Die Gesamt-DNA-Assay- und MPO/DNA-Komplex-ELISA-Daten wurden von ANOVA mit Post-hoc-Tukey-Tests unter Verwendung des aov-Pakets analysiert. Ein p-Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Die in der aktuellen Studie verwendeten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) durch das Förderprogramm für weltweit führende innovative Forschung und Entwicklung in Wissenschaft und Technologie (FIRST-Programm) finanziert. das JSPS World Premier International Research Center Initiative Funding Program; die Uehara Memorial Foundation; das Center of Innovation-Programm (COISTREAM) des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) (an AK); JSPS KAKENHI (JP18H05282 an AK, JP18K16146 an MN, JP19K23865 an PML); die Japanische Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (AMED) (20ek0109307h0003, J200705023, J200705710, J200705049, JP18cm016335 und JP18cm059042 an AK); die Kansai Economic Federation (KANKEIREN); der Mitsubishi Zaidan1 (zu AK).

Labor für Biophotonik, Immunology Frontier Research Center, Universität Osaka, Yamadaoka 3-1, Suita, Osaka, 565-0871, Japan

Patrick Michael Lelliott, Alison Jane Hobro, Nicholas Pavilion und Nicholas Isaac Smith

Abteilung für Atemwegsmedizin und klinische Immunologie, Graduate School of Medicine der Universität Osaka, Osaka, Japan

Masayuki Nishide, Yasutaka Okita, Yumiko Mizuno, Sho Obata, Shinichiro Nameki, Hanako Yoshimura und Atsushi Kumanogoh

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Atsushi Kumanogoh

Offenes und transdisziplinäres Forschungsinstitut (OTRI), Universität Osaka, Osaka, Japan

Atsushi Kumanogoh und Nicholas Isaac Smith

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PML, AJH, NP und NIS haben die Studie konzipiert und gestaltet. PML führte die Experimente durch. MN, YO, YM, SO, SN, HY und AK trugen zur Datenerfassung bei. PML, AJH, NP und NIS analysierten und interpretierten die Daten. PML und AJH haben das Manuskript geschrieben. NP, MN und NIS haben das Manuskript überprüft und bearbeitet. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts überarbeitet und genehmigt.

Korrespondenz mit Patrick Michael Lelliott oder Nicholas Isaac Smith.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lelliott, PM, Hobro, AJ, Pavillon, N. et al. Einzelzell-Raman-Mikroskopie mit maschinellem Lernen hebt deutliche biochemische Merkmale von extrazellulären Neutrophilenfallen und Nekrose hervor. Sci Rep 13, 10093 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36667-3

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Eingegangen: 13. April 2023

Angenommen: 07. Juni 2023

Veröffentlicht: 21. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36667-3

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