Kristallstruktur eines Subtilisins

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1163 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Autotransporter (ATs) sind eine große Familie von bakteriell sezernierten Proteinen und Proteinen der Außenmembran, die ein breites Spektrum enzymatischer Aktivitäten umfassen, die häufig mit pathogenen Phänotypen in Verbindung gebracht werden. Wir präsentieren die strukturelle und funktionelle Charakterisierung eines Subtilase-Autotransporters, Ssp, aus dem opportunistischen Erreger Serratia marcescens. Obwohl die Strukturen von Subtilasen gut dokumentiert sind, ist dieses Subtilisin-ähnliche Protein mit einer 248 Reste langen β-Helix verbunden und weist selbst drei fingerartige Vorsprünge um sein aktives Zentrum auf, die an Substratinteraktionen beteiligt sind. Wir zeigen außerdem, dass die Aktivität der Subtilase AT für den Eintritt in Epithelzellen sowie für die Verursachung zellulärer Toxizität erforderlich ist. Die Ssp-Struktur liefert nicht nur Details über die Subtilase-ATs, sondern offenbart auch ein gemeinsames Gerüst und eine gemeinsame Funktion für weiter entfernt verwandte ATs. Daher stellen diese Erkenntnisse auch einen bedeutenden Fortschritt beim Verständnis der molekularen Mechanismen dar, die der funktionellen Divergenz in der großen AT-Superfamilie zugrunde liegen.

Subtilasen sind eine vielfältige Gruppe meist extrazellulärer Proteasen, die in Bakterien, Archaeen und Eukaryoten vorkommen. Die Subtilisin-ähnliche Proteingruppe stellt nach der (Chymo)trypsin-Proteasenfamilie die zweitgrößte Familie der Serinproteasen dar1. Subtilasen spielen eine Rolle bei einer Vielzahl biologischer Funktionen, darunter bakterielle und virale Infektionen, Tumorentstehung und Metastasierung, Krankheitspathogenese, Pflanzenwachstum und -entwicklung, und werden auch in der Industrie weltweit als Zusatzstoffe in Wasch- und Geschirrspülmitteln eingesetzt2,3,4,5, 6. Obwohl Subtilasen ausführlich untersucht wurden, findet man eine einzigartige und weitgehend uncharakterisierte Gruppe von Subtilasen als Teil der Protein-Superfamilie der bakteriellen Autotransporter (AT).

Autotransporter (ATs) sind die größte Familie sekretierter Proteine ​​in gramnegativen Bakterien, von denen viele eine wichtige Rolle bei bakteriellen Infektionen und Krankheiten spielen, einschließlich der Anheftung an und Eindringen in Wirtszellen, der Bildung von Biofilmen sowie als starke Zytotoxine und Immunmodulatoren6,7. ATs haben eine konservierte Domänenstruktur, die ein Signalpeptid für den Sec-abhängigen Transport durch die innere Bakterienmembran und eine C-terminale Translokatordomäne für die Sekretion einer Passagierdomäne über die äußere Membran umfasst (Abb. 1a). Der an der Oberfläche transportierte Passagier ist für die verschiedenen Rollen in der bakteriellen Pathogenese verantwortlich (Abb. 1a), wobei spezifische Domänenarchitekturen es ATs ermöglichen, unterschiedliche Funktionen zu besitzen, einschließlich enzymatischer Aktivitäten wie Protease-, Lipase- und Phosphatase-Aktivität.

Subtilase-ATs umfassen eine der beiden AT-Familien, die über Proteaseaktivität verfügen, während die andere die (Chymo)trypsin-ähnlichen Protease-ATs sind, zu denen SPATEs (Serinprotease-Autotransporter von Enterobactericeae) gehören. Die letztere Gruppe sind wohl die am besten charakterisierten ATs, die als Teil ihres Passagiers eine dreisträngige β-Helix mit einer N-terminalen Protease-Subdomäne integrieren8. Beispielsweise enthalten SPATEs wie das plasmidkodierte Toxin (Pet) eine β-Helix mit etwa 600 Resten und einer N-terminalen (Chymo-)Trypsin-ähnlichen Subdomäne, die Substrate, einschließlich Spektrin, spaltet, was zu einer Zerstörung des Zytoskeletts führt9. Im Vergleich dazu gibt es weniger Informationen über Subtilase-ATs, eine große Gruppe von Proteinen, die in bakteriellen Krankheitserregern vorkommen, darunter Pseudomonas spp10,11,12,13,14, Neisseria meningitidis15 und Bordetella pertussis16. Zu den besser untersuchten Subtilase-ATs gehören B. pertussis SphB1 und N. meningitidis NalP, beide lipidiert17,18 und nachweislich verschiedene Oberflächenproteine ​​wie filamentöses Hämagglutinin16 und die Protease IgA bzw. das Lactoferrin-bindende Protein LbpB15,19. Insgesamt zeigt die bisherige Forschung, dass viele Subtilase-ATs offenbar eine Rolle bei der bakteriellen Pathogenese spielen, z. B. indem sie zytopathische Wirkungen auf Wirtszellen hervorrufen, Serumresistenz und Biofilmbildung verleihen, Rollen, die offenbar auch bei der (Chymo-)Trypsin-ähnlichen Protease ATs10 üblich sind ,13,20,21,22,23.

Die erste charakterisierte Subtilase AT war Ssp (PrtS) aus Serratia marcescens IFO-3046. S. marcescens ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der eine Reihe von Tieren und Pflanzen infizieren kann24,25, und beim Menschen verursacht S. marcescens bekanntermaßen verschiedene Infektionen, darunter Atemwegserkrankungen, Blutkreislauf- und Harnwegsinfektionen, und hat alarmierenderweise Resistenzen gegen viele häufig eingesetzte Bakterien entwickelt Antibiotika24,26. Die Rolle von Ssp bei diesen Infektionen ist unbekannt; jedoch eine Variante von Ssp aus Serratia sp. Es wurde festgestellt, dass aus Kiefern isoliertes A88copa13 (98 % Identität im Passagier) hauptsächlich für die Zytotoxizität gegenüber dem Nematoden Bursaphelenchus xylophilus verantwortlich ist, dem Erreger der Kiefernwelkekrankheit27. Frühere Studien zu Ssp konzentrierten sich weitgehend auf seinen Transportmechanismus von der inneren Zytosolmembran zur äußeren Bakterienmembran und seine Freisetzung von der Zelloberfläche28,29,30,31,32. Es wird angenommen, dass Ssp wie andere Subtilase-ATs vorübergehend an der Bakterienoberfläche gebunden bleibt, bevor es abgespalten und in die Umwelt freigesetzt wird28. Allerdings liegen für Ssp33, ähnlich wie bei anderen Subtilase-ATs, keine strukturellen und nur wenige funktionelle Daten vor.

Hier in unserer Untersuchung von Ssp beschreiben wir die detaillierte Struktur-/Funktionsanalyse einer Subtilase AT. Wir zeigen, dass sich Ssp in eine einzigartige Subtilasedomäne faltet, gefolgt von einer kurzen β-Helix, ein Gesamtlayout, das dem von SPATEs ähnelt. Darüber hinaus zeigen wir, dass beide Arten von Protease-ATs auch funktionelle Ähnlichkeiten aufweisen, wobei wir zeigen, dass Ssp in Epithelzellen eindringen und abhängig von seiner Subtilaseaktivität zytopathische Effekte verursachen kann. Diese Erkenntnisse dienen nicht nur dazu, die Lücke zwischen diesen beiden großen Gruppen von ATs zu schließen, sondern tragen auch zur Vielfalt der Subtilasen und Subtilisin-ähnlichen Proteasen bei.

Um die molekularen Details der weitgehend unerforschten AT-Subtilase-Untergruppe zu verstehen, wurde das Gen verwendet, das für Ssp in voller Länge aus S. marcescens IFO-304628 kodiert und die N-terminale Signalsequenz, gefolgt von den Passagier- und Translokatordomänen, enthält subkloniert in pBAD/Myc-His-B und exprimiert in E. coli BL21(DE3). Ein überexprimiertes 66 kDa großes sekretiertes Protein, das der reifen Form des gespaltenen Ssp-Passagiers entsprach, wurde zur weiteren Charakterisierung aus dem Kulturüberstand isoliert und gereinigt. Die Tryptic-Digest-LC-MS/MS-Analyse bestätigte den Ssp-Passagier (75 % Sequenzabdeckung) mit Daten, die mit der Spaltung an Ala27 und Asp645 übereinstimmen, wodurch der Passagier vom Translokator freigesetzt wurde31 (Abb. 1a). Diese Autoproteolyse wurde bereits für Ssp30 beobachtet, wobei der Mechanismus für andere Serinprotease-Autotransporter gut charakterisiert ist34. Es wurde auch festgestellt, dass rekombinantes Ssp unter Verwendung eines fluorogenen Substrats auf Kaseinbasis proteolytisch aktiv ist (siehe unten Abb. 3c).

Um die dreidimensionale Struktur von Ssp mittels Röntgenkristallographie zu bestimmen, wurden isomorphe Kristalle sowohl für unmarkierten als auch für mit Selenomethionion (SeMet) markierten Ssp-Passagier erhalten. Ein vorläufiges Teilmodell von Ssp wurde basierend auf dem IcsA-Autotransporter (PDB: 5KE1)35 unter Verwendung des Homologiemodellservers SWISS-MODEL36 erstellt. Eine Reihe von SeMet-Datensätzen wurden zusammengeführt, die zusammen mit dem Ssp-Modell verwendet wurden, um die Struktur mithilfe von Single Isomorphous Replacement with Anomalous Scattering (SIRAS) und Molecular Replacement with Single Wavelänge Anomalous Diffraction (MRSAD) zu lösen. Ein Ssp-Molekül ist in der asymmetrischen Einheit vorhanden, wobei die resultierende Struktur anhand eines nativen Datensatzes mit höherer Auflösung (2,0 Å) mit einem endgültigen und einem Rfaktor/Rfreien Wert von 16,3/20,1 verfeinert wurde (kristallographische Statistik in Tabelle 1).

Diese Struktur von Ssp ergab, dass es aus einer N-terminalen Subtilisin-ähnlichen Proteasedomäne und einer C-terminalen dreisträngigen β-helikalen Domäne besteht (Abb. 1b). Die Subtilasedomäne von Ssp ist direkt auf der β-helikalen Domäne positioniert und bedeckt im Wesentlichen das β-helikale Gerüst (Abb. 1b). Sowohl die Subtilasedomäne als auch die architektonische Anordnung dieser Domäne mit der β-helikalen Domäne wurden in bislang ermittelten AT-Strukturen nicht beobachtet und unterscheiden sich von den SPATEs, deren Subdomänen, einschließlich der Serinproteasedomäne, aus der Seite herausragen β-helikaler Stiel (Ergänzende Abbildung 1)37,38,39,40,41. Nichtsdestotrotz bestätigt das Vorhandensein der β-Helix in Ssp die Beziehung von Subtilase-ATs zu anderen wichtigen AT-Gruppen wie den SPATEs und den selbstassoziierenden ATs.

ein lineares Schema der Primärsequenz von Ssp, die ein N-terminales Signalpeptid (SP) und eine C-terminale Translokatordomäne umfasst, die den zentralen Passagier flankiert. Reste des aktiven Zentrums in der Subtilasedomäne werden durch eine rote Linie dargestellt, Selbstspaltungsstellen durch grüne Pfeile. b Kristallstruktur, die die Gesamtarchitektur des Ssp-Passagiers in Cartoon-Darstellung zeigt. Die Subtilase-(Protease-)Domäne ist blau dargestellt, wobei die Reste des aktiven Zentrums als rote Kugeln dargestellt sind. Die β-Helix-Stieldomäne ist gelb dargestellt, mit hervorstehender β-Helix-Schleife 1 und Schleife 2, jeweils rostfarben und grün gefärbt. Das Passenger-Associated-Transport-Repeat (PATR) wird in Pink dargestellt und das RGD-Motiv als rosa Stäbchen, die α-Helix-Schleife in Orange und die β-Haarnadelkappe an der Basis des Passagiers sind in Dunkelblau gefärbt. Calciumionen werden als rosafarbene Kugeln dargestellt, wobei diejenigen, die an die Proteasedomäne gebunden sind, nach Dohnalek et al. markiert sind. Nomenklatur57. c Proteasedomäne von Ssp in Cartoon-Darstellung, die die einzigartigen Vorsprünge des aktiven Zentrums zeigt (E1–E3). Nämlich kurze β-Haarnadelverlängerung (E1, rosa), lange β-Haarnadelverlängerung (E3, grün) und verlängerte Schleifenverlängerung mit verbundener α-Helix (E2, orange). Die aktive Site wird als rote Stäbchen angezeigt. d Ssp-Proteasedomäne mit zentralem β-Faltblatt und α-Helices, dargestellt in Pink bzw. Jade. Die Disulfidbindung wird als gelbe Stäbchen dargestellt.

Die Kernarchitektur der Proteasedomäne von Ssp ist typisch für die Subtilisin-ähnlichen Faltungen, die bei anderen Subtilaseenzymen beobachtet werden42. Es besteht aus einer kugelförmigen α/β-Faltung in der Mitte mit einem verdrillten siebensträngigen parallelen β-Faltblatt neben zwei zentralen α-Helices und umfasst die Reste des aktiven Zentrums D76, H112 und S341 (Abb. 1c, d und 2c). Eine Disulfidbindung (Cys288 zu Cys295) verbindet den letzten β-Strang des β-Faltblatts mit seiner vorhergehenden Schleife (Abb. 1d). Die DALI-Analyse43 ergab, dass das Protein, das Ssp strukturell am ähnlichsten ist, Subtilisin BPN' aus Bacillus amyloliquefaciens ist (31 % Identität, PDB: 1LW6, Z-Score: 32,3) mit einem RMSD von 2,0 Å über 255 Cα-Atome. Die Überlagerung der beiden Strukturen bestätigt einen ähnlichen zentralen α/β-Kern, wobei die Reste des aktiven Zentrums von Ssp gut mit denen von Subtilisin BPN' überlappen (Abb. 2a, b).

a Überlagerung der Kristallstruktur der Subtilasedomäne von Ssp (blau) und Subtilisin BPN' (grau, PDB: 1LW644. Reste des aktiven Zentrums sind in roten Strichen dargestellt. Subtilisin BPN'-Reste 98–109, die in Ssp fehlen und die bilden Breitere Substratbindungsspalten sind in Lila dargestellt. b Nahaufnahme der Reste des aktiven Zentrums mit Ssp in Blau und Subtilisin BPN' in Grau. Die katalytische Ssp-Triade ist markiert. c 2Fo-Fc-Elektronendichtekarte, konturiert bei 1σ, die das aktive Zentrum der Ssp-Subtilase umfasst. d Draufsicht auf das aktive Zentrum von Subtilisin BPN' im Komplex mit dem Inhibitor CI2 (P5-P2'-Reste zur Verdeutlichung dargestellt). Subtilisin BPN'-Reste 98–109 sind violett dargestellt. e Elektrostatische Oberfläche von Subtilisin BPN' im Komplex mit CI2 mit Protease. Unterstellen sind im Einschub gekennzeichnet. f Draufsicht auf das aktive Zentrum von Ssp. Die einzigartigen Erweiterungen des aktiven Zentrums von Ssp sind hervorgehoben, nämlich kurze β-Haarnadelverlängerung (E1, rosa) und lange β-Haarnadelverlängerung (E3, grün) und erweiterte Schleifenverlängerung mit verbundener α-Helix (E2, orange). Die aktive Site wird rot angezeigt. g Elektrostatische Oberfläche der Ssp-Proteasedomäne. Mutmaßliche Protease-Unterstellen sind im Einschub angegeben. Die elektrostatischen Oberflächenpotentiale wurden mit dem APBS-Plugin in Pymol berechnet, wobei das elektrostatische Potential von negativ (rot) bis positiv (blau) in einem Bereich von ±5 kT/e gefärbt wurde.

Wir konstruierten eine ortsspezifische Mutante von Ssp, Ssp-S341A, die das zuvor identifizierte Serin im aktiven Zentrum von Ssp (29) bestätigte, da es keine Aktivität gegen ein Substrat auf Kaseinbasis zeigte (Abb. 3c). Darüber hinaus bestätigte die Unfähigkeit von Ssp-S341A, bei Expression in E. coli BL21(DE3) im Gegensatz zu Wildtyp-Ssp in das Kulturmedium freigesetzt zu werden, die Rolle der Ssp-Subtilasedomäne bei der Vermittlung seiner Selbstspaltung und Freisetzung aus die bakterielle Zelloberfläche. Im Gegensatz dazu wurde Ssp-S341A bei der Expression in E. coli Top10 durch Spaltung durch OmpT31 in das Kulturmedium freigesetzt. Die verbleibenden Reste des aktiven Zentrums Asp76 und His112 wurden anhand der Sequenzkonservierung mit anderen Subtilasen (ergänzende Abbildung 2) und ihrer engen Nähe zu Wasserstoffbrückenbindungen innerhalb der Struktur identifiziert.

eine Kristallstruktur von Ssp in Cartoon-Darstellung, die den Ort der Mutationen zeigt. b SDS-PAGE-Analyse des Kulturüberstands aus der Expression von Ssp-Varianten in E. coli Top10. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. c Proteaseaktivität von Ssp-Varianten unter Verwendung eines fluoreszierenden Kaseinsubstrats. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Zu den Ssp-Varianten gehören Wildtyp (WT), Deletionen von Loop 2 (ΔL2), Deletion der Vorsprünge E2 und E3 des aktiven Zentrums (ΔE2, ΔE3, ΔE2/ΔE3) und ortsspezifische Mutanten des Ser- (S314A) und RGD-Motivs des aktiven Zentrums (RAE). pBAD bezeichnet eine reine Vektorkontrolle. Der Mittelwert wird mit Fehlerbalken aufgetragen, die die Standardabweichung der technischen Replikate darstellen (n = 3). Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.

Im Vergleich zum Subtilisin BPN' sitzt die katalytische Triade am Boden einer tiefen Spalte, die aus zwei hervorstehenden β-Haarnadeln (E1 und E3) auf der einen Seite und einer verlängerten Schleife (E2) auf der anderen Seite besteht (Abb. 1b, c ), die in Subtilisin BPN' fehlen (Abb. 2a). Dieser markante Eingang zum aktiven Zentrum, der sich oben im AT befindet, wird durch drei Hauptinsertionen in der Ssp-Sequenz gebildet (ergänzende Abbildung 2a). Darüber hinaus verbindet sich der erweiterte Schleifenvorsprung (E2) mit einer α-Helix, die sich um die Seite der Subtilasedomäne von Ssp wickelt, eine weitere einzigartige Ergänzung (Abb. 1c). Wir untersuchten die Rolle der einzigartigen fingerartigen Vorsprünge E1–E3, die mit dem aktiven Zentrum der Ssp-Subtilasedomäne verbunden sind, indem wir Deletionsmutanten Ssp-ΔE2, Ssp-ΔE3 und Ssp-ΔE2/E3 erzeugten (Abb. 3 und Ergänzungstabelle 1). Es wurde festgestellt, dass Ssp-ΔE1 instabil ist und kurz nach der Sekretion abgebaut wird. Es wurde festgestellt, dass die Entfernung der Schleife E2 die Subtilaseaktivität fast vollständig aufhob, wohingegen die Entfernung der α-Helix, die die E3-β-Haarnadel verschönerte, im Vergleich zum Wildtyp-Ssp eine geringere Aktivitätsabnahme aufwies (Abb. 3c). Diese Daten unterstützen eine Rolle der hervorstehenden Schleifen bei der Substraterkennung und -bindung für die Ssp-Subtilasefunktion.

Ein weiterer detaillierter Vergleich der Substratbindungsstelle von Ssp und Subtilisin BPN' zeigte einen bemerkenswerten Unterschied zwischen den beiden Enzymen. Ssp weist eine Deletion auf, die den Resten 98–109 von Subtilisin BPN' (Abb. 2a, d und ergänzende Abb. 2a, c) entspricht und an die S4-Unterstelle von Subtilisin BPN' angrenzt. Dies führt zu einer verkürzten α-Helix und vergrößert den Bindungsspalt (Abb. 2f, g), was möglicherweise eine ausgedehntere Substratbindungsschnittstelle ermöglicht.

Die potenziellen einzelnen Substratbindungstaschen von Ssp wurden identifiziert, indem die Struktur von Subtilisin BPN' im Komplex mit dem Inhibitor CI2 (PDB: 1LW6)44 mit der Subtilasedomäne von Ssp überlagert wurde. Die gebundene Schleife der reaktiven Stelle von CI2 lieferte einen Leitfaden zu den Unterstellenpositionen in Ssp (Abb. 2e, g). Aus dieser Analyse geht hervor, dass die Ssp-Substratbindungsstelle in der Lage ist, mindestens fünf Reste P1–P5 (Abb. 2g) auf der N-terminalen, nichtprimären Seite der spaltbaren Bindung zu binden, im Vergleich zu vier Resten (P1–P4). für Subtilisin BPN' (Abb. 2e). Darüber hinaus zeigten die elektrostatischen Eigenschaften der Ssp-Substratbindungsregion, dass sie positiver geladen ist als die von Subtilisin BPN' (Abb. 2e, g). Tatsächlich scheinen die zuvor identifizierten mutmaßlichen S1- und S5-Unterstellen von Ssp stark positiv geladen zu sein, was darauf hindeutet, dass sie wahrscheinlich die Bindung negativ geladener Aminosäuren an diesen Positionen begünstigen. Es ist bekannt, dass Ssp sich an drei verschiedenen Positionen spaltet, wodurch der Passagier vom Translokator auf der Bakterienzelloberfläche befreit wird (Abb. 1a)29,31. Bemerkenswert ist, dass diese von Ssp erkannten identifizierten Sequenzen (Ergänzungstabelle 2) tatsächlich eine Präferenz für negativ geladene Reste in der P1- und P5-Position des Substrats zeigen, was mit den positiv geladenen mutmaßlichen S1- und S5-Unterstellen korreliert.

Die Proteasedomäne von Ssp sitzt oben auf der β-helikalen Stieldomäne (Abb. 1b). Diese β-Helix ist ein gemeinsames Gerüst, das in den meisten bisher ermittelten AT-Strukturen vorkommt39,45,46,47,48,49,50,51. Die DALI-Analyse43 ausschließlich des β-helikalen Stiels von Ssp ergab, dass diese Domäne eine geringe strukturelle Ähnlichkeit mit bekannten Strukturen aufweist, wobei die größte Übereinstimmung das C-terminale Fragment des AT IcsA von Shigella flexneri ist (15 % Identität, PDB: 5KE1, Z- Punktzahl: 15,7) mit einem RMSD von 3,0 Å über 197 Cα-Atome.

Interessanterweise ist die Ssp-β-Helix die kürzeste, die bisher für ein AT beobachtet wurde. Sie besteht aus sieben rechtsdrehenden dreieckigen Windungen (ca. 40 Å lang), wobei die letzten drei β-Strang-Sprossen einer Autochaperondomäne ähneln (ergänzende Abbildung 3). und Ergänzungstabelle 3), von denen frühere Studien gezeigt haben, dass sie an der Faltung von AT-Passagieren beteiligt sind52,53. Interessanterweise markiert eine kurze α-Helix in Kurve 7 die Grenze zwischen der β-Helix aus der Autochaperonregion (Abb. 1b).

Dieser Größenunterschied der β-Helix ist signifikant im Vergleich zu anderen ATs bekannter Struktur, die β-Helices zwischen 13 und 24 Windungen (87–120 Å Länge) aufweisen (ergänzende Abbildung 1). Die β-Helix von Ssp wird durch ein Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert, die zwischen den parallelen β-Strängen gebildet werden, die die dreisträngige Struktur bilden, und ist durch ein C-terminales β-Haarnadelmotiv abgedeckt.

Es gibt zwei Schleifen, die von der ersten Windung der β-Helix ausgehen: Schleife 1 (Reste 405–421) und Schleife 2 (Reste 431–450) (Abb. 1b), wobei letztere zwei antiparallele β-Stränge umfasst und eine Disulfidbindung (Cys445 bis Cys450). Diese Schleifen erinnern an diejenigen, die auf SPATEs wie den Pet-Subdomänen d2 und d4 vorhanden sind, wobei d2 nachweislich an der Bindung und Internalisierung in Epithelzellen beteiligt ist54.

Der β-helikale Stiel von Ssp enthält ein PATR-Motiv (Passagier-Associated-Transport-Repeat) (Reste 464–496, Abb. 1b). Diese konservierte Wiederholung kommt in vielen ATs vor und hat sich nachweislich als wichtig für die effiziente Sekretion des Passagiers erwiesen55. Darüber hinaus ist ein RGD-Motiv (Reste 482–484) in die PATR-Region eingebettet (Abb. 1b). Das RGD-Motiv ist eine bekannte Integrin-Bindungssequenz, die die Zelladhäsion56 erleichtert und daher möglicherweise an der biologischen Funktion von Ssp beteiligt ist.

Die strukturelle Charakterisierung von Ssp ergab das Vorhandensein von drei Calciumbindungsstellen, zwei in der Subtilasedomäne und eine in der β-helikalen Stieldomäne (Abb. 1b). Das erste Calciumion ist einer häufig vorkommenden Calciumbindungsstelle mit hoher Affinität zugeordnet (Ca-I, Nomenklatur von Dohnalek et al.57), die in vielen Subtilasen wie Subtilisin BPN' zu finden ist. In Ssp wird Ca-I von Glu45, Glu84 und Asp125 koordiniert und weist Rückgratkontakte zu Lys123, Ala127 und Met129 auf (ergänzende Abbildung 4a). Im Vergleich dazu scheint die zweite Calciumbindungsstelle (Ca-IV, Nomenklatur von Dohnalek et al.57) weniger häufig vorzukommen als die Stelle, die erstmals in Sedolisin (früher als PSCP bekannt) charakterisiert wurde, einer Subtilisin-ähnlichen Protease aus der strukturell verwandten S53-Proteasefamilie58 . Die strukturelle Ausrichtung von Ssp und Sedolisin (PDB: 1GA1) zeigt, dass Ca-IV durch ähnliche Reste, Asp328, Asp348, koordiniert wird und Rückgratkontakte zu Val329, Gly344 und Gly346 in Sedolisin aufweist, im Vergleich zu Asp376, Asp383 und Rückgratkontakte zu Val376, Leu377 und Gly381 in Ssp (Ergänzende Abbildung 4b). Das in der β-helikalen Stieldomäne gefundene Calciumion wird durch das Rückgrat von Pro529 und Gly532 aus einer Schleife koordiniert, die sich von Kurve 5 erstreckt, und von Glu553 und Asp561 aus Kurve 6 (ergänzende Abbildung 4c). Zusammen mit einer Schleife aus Kurve 7 bilden diese Windungen eine Tasche für das Kalzium am C-Terminus der β-Helix.

Neben anderen Aufgaben ist Kalzium dafür bekannt, die Strukturen vieler Enzyme zu stabilisieren42. Es wurde festgestellt, dass ortsspezifische Mutagenese an der Calciumbindungsstelle von Sedolisin dessen Proteaseaktivität verringert59. Um den Beitrag von Ca2+ zur strukturellen Stabilisierung von Ssp zu untersuchen, wurde die scheinbare thermische Schmelztemperatur (Tmapp) von Ssp bestimmt. Es wurde festgestellt, dass Ssp in Gegenwart von Ca2+ stabiler und in Gegenwart des Ca2+-Chelators EDTA thermisch weniger stabil ist (Ergänzungstabelle 4), mit einem Unterschied von 4,8 °C. Interessanterweise hatte das Vorhandensein oder Fehlen einer Ca2+-Bindung keinen Einfluss auf die Subtilaseaktivität von Ssp (ergänzende Abbildung 5).

Es wurde gezeigt, dass verschiedene Protease-ATs sowohl aus der SPATE- als auch der Subtilase-Familie bei Säugetieren eine Rundung, Ablösung und Lyse verursachen10,20,21,22,23,60,61, was in vivo zur Gewebezerstörung führen kann. HEp-2-Zellen (HeLa-Derivat) sind eine der am häufigsten in diesen Studien verwendeten Zelllinien9,18,55,56. Um diese Funktion weiter zu untersuchen, wurden Ssp-haltige Top10-Überstände mit HEp-2-Monoschichten inkubiert, was dazu führte, dass die Zellen rund wurden und schließlich zur Zellablösung führten (Abb. 4a). Dieser Phänotyp wurde in der Mutante des aktiven Zentrums, Ssp-S341A, nicht beobachtet. Darüber hinaus zeigten die Ssp-Protrusionsmutanten des aktiven Zentrums ein ähnliches Subtilase-Aktivitätsprofil gegenüber HEp-2-Zellen, wie es gegenüber dem kaseinbasierten Substrat (Abb. 3c) mit Ssp-ΔE2 und Ssp-ΔE2/E3 beobachtet wurde, das eine Aktivität von ~5 % aufwies gegen das Caseinsubstrat, was zu einer geringeren Zellrundung führte als Ssp-ΔE3, das ~80 % der Proteaseaktivität beibehielt (Abb. 4a). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Ssp-Subtilase-Aktivität eine Zellrundung und -ablösung verursacht, wobei die fingerartigen Vorsprünge E2 und E3 eine Rolle bei der Erkennung und Bindung an zelluläre Ziele spielen. Obwohl eine Zellrundung und Ablösung von HEp-2-Zellen beobachtet wurde, verursachte Ssp interessanterweise keine Zelllyse, wie durch die LDH-Freisetzung bestimmt, selbst wenn das Protein 24 Stunden lang mit HEp-2-Zellen inkubiert wurde (Abb. 4b).

a HEp-2-Zellen wurden mit konzentrierten Kulturüberständen von Ssp-Varianten (25 μg/ml) 30 Minuten lang inkubiert und mittels DIC-Mikroskopie abgebildet. Der Maßstabsbalken stellt 100 μm dar. Zu den Ssp-Varianten gehören Wildtyp (WT), Deletion der Vorsprünge E2 und E3 des aktiven Zentrums (ΔE2, ΔE3, ΔE2/ΔE3) und ortsspezifische Mutanten des aktiven Zentrums (S314A). pBAD bezeichnet eine reine Vektorkontrolle. Es wurde eine Zellrundung beobachtet: WT ca. 75 %, pBAD ca. 5 %, S341A ca. 5 %, ΔE2 ca. 20 %, ΔE3 ca. 50 %, ΔE2/ΔE3 ca. 10 %. b Die Zytotoxizität von Ssp wurde durch Inkubation mit HEp-2-Zellen gemessen und die Freisetzung von LDH gemessen. Der Mittelwert wird mit Fehlerbalken aufgetragen, die die Standardabweichung der technischen Replikate darstellen (n = 3). Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.

Da bekannt ist, dass eine Reihe von ATs wie SPATE Pet und Subtilase AT NalP aus N. meningitidis in Säugetierzellen eindringen und dort ihre Wirkung entfalten21,62, wollten wir herausfinden, ob Ssp auch von HEp-2-Zellen internalisiert wird. Die Top10-Überstände, die Ssp enthielten, wurden mit HEp-2-Zellen inkubiert, gewaschen, permeabilisiert, mit einem polyklonalen Anti-Ssp-Antikörper immungefärbt und durch konfokale Mikroskopie beobachtet. Die Bildgebung zeigte, dass Ssp im Zytoplasma der Zellen gefunden wurde, was darauf hindeutet, dass Ssp von HEp-2-Zellen internalisiert wird (Abb. 5).

Konfokale Mikroskopiebilder von HEp-2-Zellen, die 5 Stunden lang mit konzentrierten Kulturüberständen von Ssp-Varianten (25 μg/ml) inkubiert wurden. Ssp wurde mit einem polyklonalen Anti-Ssp-Antikörper sichtbar gemacht, gefolgt von einem mit Alexa Fluor Plus 647 konjugierten sekundären Antikörper (gelb), das Aktin-Zytoskelett wurde mit Phalloidin (magenta) und der Zellkern mit DAPI (cyan) gefärbt. Zu den Ssp-Varianten gehören Wildtyp (WT), Deletionen von Loop 2 (ΔL2), Deletion der Vorsprünge E2 und E3 des aktiven Zentrums (ΔE2, ΔE3, ΔE2/ΔE3) und ortsspezifische Mutanten des Ser- (S314A) und RGD-Motivs des aktiven Zentrums (RAE). pBAD bezeichnet eine reine Vektorkontrolle. Die Bilder sind repräsentativ für Zellen, die in mindestens drei unabhängigen Experimenten beobachtet wurden. Der Maßstabsbalken stellt 50 μm dar.

Auf der Pet-β-Helix wurde festgestellt, dass eine Schleife mit 57 Resten (Subdomäne d2) die Bindung und Internalisierung von Pet in HEp-2- und HT-29-Zellen fördert54. Daher erzeugten wir Deletionsmutanten von Ssp, denen entweder β-Helix-Loop 1 (Reste 405–421, Ssp-ΔL1) oder Loop 2 (Reste 431–450, Ssp-ΔL2) fehlten, und erzeugten außerdem Aminosäuresubstitutionen am RGD-Zellbindungsmotiv (Reste 482–484, Ssp-RAE), das Teil der PATR-Region ist (Abb. 1a). Sowohl Ssp-ΔL2 als auch Ssp-RAE wurden exprimiert und erwiesen sich als aktiv in einem vergleichbaren Ausmaß wie Wildtyp-Ssp (Abb. 3b, c). Allerdings war bei keinem der Ssp-Mutanten die Fähigkeit zur Förderung der Abrundung, Ablösung und Ablösung von HEp-2-Zellen verringert. und Internalisierung (Abb. 5). Daher sind diese β-Helix-assoziierten Merkmale von Ssp im Gegensatz zur d2-Subdomäne in Pet für diese Prozesse nicht erforderlich. Da Ssp-ΔL1 nach der Expression nicht stabil war, konnte die Wirkung von Schleife 1 auf die Ssp-vermittelte Zellrundung und Internalisierung nicht bestimmt werden.

Als nächstes untersuchten wir die Wirkung der Subtilaseaktivität auf die Internalisierung durch HEp-2-Zellen. Die Mutante des aktiven Zentrums, Ssp-S341A, zeigte keinen Eintritt in die Epithelzellen, was darauf hindeutet, dass die Internalisierung von Ssp auch von seiner Subtilaseaktivität abhängt (Abb. 5). Dieser Befund steht im Gegensatz zu den meisten zuvor untersuchten ATs und legt daher einen anderen Weg des Eintritts von Ssp in Zellen nahe, wo seine Subtilasefunktion eine aktive Rolle spielt. Es wurde auch gezeigt, dass Ssp-Protrusionsmutanten des aktiven Zentrums, Ssp-ΔE2, Ssp-ΔE3 und Ssp-ΔE2/E3, die eine abgeschwächte Proteaseaktivität aufweisen, von HEp-2-Zellen internalisiert werden (Abb. 5), was darauf hindeutet, dass sogar 5 % der Wildtyp-Aktivität reicht für die Ssp-Internalisierung aus.

Da Ssp zytopathische Wirkungen auf menschliche Epithelzellen hervorruft, untersuchten wir seine Wirkungen in vivo. S. marcescens hat als opportunistischer Krankheitserreger ein vielfältiges Wirtsspektrum, einschließlich Insekten; Daher wurde die In-vivo-Toxizität von Ssp in einem Galleria mellonella-Larvenmodell getestet. Gereinigtes Ssp-WT in unterschiedlichen Konzentrationen wurde durch Intra-Hämocoel-Injektion verabreicht und die Larvenmortalität wurde überwacht (Tabelle 2). Bei einer Dosierung über 18,75 nmol/kg (2,5 mg/kg) wurde eine Mortalität beobachtet, wobei die Larven bei den höheren Dosen zu 100 % absterben. Es wurde festgestellt, dass diese Toxizität von der Ssp-Subtilaseaktivität abhängt, wobei PMSF-inaktiviertes Ssp bei Verabreichung von 150 nmol/kg (10 mg/kg) keine Mortalität verursacht. Bezeichnenderweise wurde bei der Verabreichung von gereinigtem Ssp-ΔE2, das im Vergleich zum Wildtyp eine Aktivität von etwa 5 % aufweist, bei allen Dosen keine Mortalität beobachtet, was die Bedeutung der einzigartigen fingerartigen Vorsprünge des aktiven Zentrums für die Aktivität und damit die Toxizität von Ssp bestätigt.

Hier präsentieren wir die strukturelle und funktionelle Charakterisierung eines Subtilase-AT, Ssp aus S. marcescens, das eine große Gruppe wichtiger Subtilase-ATs innerhalb der größeren Familie darstellt. Innerhalb der erweiterten AT-Familie ist Ssp erst die dritte Enzymklasse mit einer bestimmten Struktur, die signifikante Unterschiede zu den zuvor bestimmten (Chymo)Trypsin-ähnlichen Proteasen und Esterasen ATs aufweist40,63. Abgesehen von Variationen im Zusammenhang mit den verschiedenen enzymatischen Domänen wurde festgestellt, dass Ssp eine β-Helix einbaut, was sich von den Esterase-ATs unterscheidet, die kein β-helikales Gerüst besitzen, wie es bei EstA aus Pseudomonas aeruginosa beobachtet wird63. Die Ssp-β-Helix ist mit nur sieben Windungen die kürzeste, die bisher für einen AT ermittelt wurde. Im Vergleich dazu haben die (Chymo) Trypsin-ähnlichen Protease-ATs eine mehr als dreimal längere β-Helix mit 23–24 Windungen (ergänzende Abbildung 1). Dieser Befund steht im Gegensatz zu früheren Vorhersagen, dass in Subtilase ATs33 eine β-Helix fehlt.

Die Ssp-Subtilasedomäne weist einzigartige Merkmale auf, die in keiner der über 60 Subtilasen mit bisher ermittelten Strukturen beobachtet wurden. Zu den bemerkenswertesten Merkmalen der Ssp-Subtilasedomäne gehören neben der Bindung an eine β-Helix mit 248 Resten drei fingerartige Vorsprünge, von denen zwei β-Haarnadeln bilden, die das aktive Zentrum umgeben (Abb. 1b). Erweiterungen um das aktive Zentrum von Subtilasen kommen nicht häufig vor und kommen bei etwa 13 % der Subtilasen mit bekannten Strukturen vor. Noch ungewöhnlicher ist, dass zwei dieser Vorsprünge, die E2-Schleife und die E3-β-Haarnadel, nur bei Ssp vorkommen. Wir fanden heraus, dass die E2-Schleife und die E3-β-Haarnadel von Ssp an der Substraterkennung/-bindung beteiligt sind. Dies ähnelt dem Disulfid-gebundenen Vorsprung in der Nähe des aktiven Zentrums von AprV2 aus Dichelobacter nodosus (PDB: 3LPC), von dem durch Mutagenesestudien gezeigt wurde, dass es Substrat-Enzym-Wechselwirkungen erleichtert3. Diese Vorsprünge stehen in krassem Gegensatz zu anderen Merkmalen, die mit aktiven Subtilase-Stellen in Verbindung stehen, wie den viel größeren Protease-assoziierten Subdomänen und Fibronektin-Subdomänen, die in Streptococcus pyogenes ScpA (PDB: 3EIF)64 und Tomatensubtilase 3 (PDB: 3I6S)65 gefunden werden. Interessanterweise hat ein Abgleich mit anderen Subtilase-ATs (ergänzende Abbildung 6) gezeigt, dass Insertionen, wie die einzigartigen fingerartigen Verlängerungen, die in Ssp zu sehen sind, vorherrschend sind, was darauf hindeutet, dass diese Hinzufügungen ein Merkmal sein könnten, das von Subtilase-ATs übernommen wurde, um die Substratspezifität zu erhöhen und/oder oder Anerkennung. Ein weiteres bemerkenswertes Merkmal der Ssp-Subtilasedomäne ist eine breite Substratbindungsspalte mit einer Vorliebe für die Bindung von Substraten mit negativ geladenen Substraten an den Positionen P1 und P5. Diese Eigenschaften würden möglicherweise die Subzustandsspezifität von Ssp erhöhen.

Es wurde festgestellt, dass die Subtilaseaktivität von Ssp entscheidend für den Eintritt in menschliche Epithelzellen ist. Tatsächlich hatte die Mutante des aktiven Zentrums von Ssp-S341A keine Subtilaseaktivität und war nicht in der Lage, in HEp-2-Zellen einzudringen, während die nativen sowie andere proteolytisch aktive Ssp-Varianten, einschließlich Ssp-ΔE2 und Ssp-ΔE2/ΔE3, etwas Protease behielten Aktivität, wurden unter den experimentellen Bedingungen internalisiert, wenn auch bei letzteren Protrusionsmutanten möglicherweise mit verringerter Rate. Diese Abhängigkeit von der Subtilaseaktivität für den AT-Eintritt in eukaryotische Zellen steht im Gegensatz zur Subtilase AT NalP aus N. meningitidis; die einzige andere Subtilase AT, die direkt in Zellen eindringt und dies unabhängig von ihrer Subtilaseaktivität tut62. Die andere AT-Gruppe, die nachweislich in eukaryontische Zellen gelangt, sind die (Chymo)Trypsin-ähnlichen Serinprotease-ATs. Die am besten charakterisierten dieser Proteine ​​sind die Toxine Pet aus enteroaggregativem E. coli (EAEC) und EspC aus enteropathogenem E. coli (EPEC), die beide keine Serinproteaseaktivität benötigen, um in Epithelzellen einzudringen. Das Haustier dringt über die rezeptorvermittelte Endozytose über Cytokeratin-8 in die Epithelien ein, während EspC das Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) nutzt66,67. Offensichtlich verwendet Ssp im Vergleich zu diesen anderen ATs eine andere Strategie, um in eukaryotische Zellen einzudringen. Aufgrund seiner Co-Lokalisierung mit dem Zellkern (Abb. 5) kann Ssp jedoch über den endosomalen Weg eindringen und auf dem Weg zum Zellzytosol über den Golgi-Apparat und das endoplasmatische Retikulum gelangen. Der Ssp-Eintrittsweg ähnelt möglicherweise dem der kürzlich untersuchten (Chymo-)Trypsin-ähnlichen Protease-ATs TagB, TagC und Sha aus extraintestinalen pathogenen E. coli (ExPEC), für deren Eintritt nachweislich Proteaseaktivität erforderlich ist menschliche Zellen68.

Es wurde auch festgestellt, dass die Ssp-Subtilase-Aktivität die zytotoxische Aktivität gegen zelluläre Ziele fördert. Dies wurde durch die Zugabe von Ssp gezeigt, die eine Zellrundung und Ablösung menschlicher Epithelzellen verursachte, was bei der Mutante des aktiven Zentrums nicht und in geringerem Maße bei den Protrusionsmutanten beobachtet wurde. Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass das Ausmaß der Zellrundung die relative Proteaseaktivität der hinzugefügten Ssp-Variante widerspiegelt (Abb. 4a und 5). Dies wurde in vivo in einem G. mellonella-Modell weiter nachgewiesen, wobei Wildtyp-Ssp bei Dosen über 18,75 nmol/kg (2,5 mg/kg) Larvensterblichkeit verursachte, während PMSF Ssp und den Protrusionsmutanten des aktiven Zentrums Ssp-ΔE2 inaktivierte, der die Subtilaseaktivität abgeschwächt hat zeigte bei der höchsten Dosierung von 150 nmol/kg (10 mg/kg) keine Mortalität. Der Zusammenhang zwischen Subtilase-AT-Aktivität und Zytotoxizität wurde zuvor bei PfaI aus P. fluorescens und Pta aus P. mirabilis nachgewiesen, wobei nur proteolytisch aktives AT als zytotoxisch für Fische bzw. Blasenepithelien festgestellt wurde10,20. Darüber hinaus wurde dieser Zusammenhang bei den (Chymo)Trypsin-ähnlichen Protease-ATs weiter aufgeklärt, wobei die Serinproteasen von Pet und EspC beim Eindringen in Epithelien Fodrin verdauen, das mit dem Zellzytoskelett verbunden ist, was zu einer Rundung und Ablösung der Zellen führt21,22. Es ist in der Tat plausibel, dass die Ssp-Subtilase nicht nur den Zelleintritt fördert, sondern auch intrazelluläre Ziele verdaut, um ihre zytotoxischen Wirkungen zu fördern, aber dies muss noch bestätigt werden.

Es wurde festgestellt, dass das β-Helix-Gerüst in allen ATs unabhängig von der AT-Gruppe eine Rolle bei der Bindung von Wirts- und Bakterienfaktoren spielt. Es wurde festgestellt, dass eine von der Pet-β-Helix abgeleitete Schleifenverlängerung, die als d2-Subdomäne bezeichnet wird, vor dem Eintritt mit dem Cytokeratin-8-Rezeptor auf Epithelzellen interagiert66. Allerdings hatte die Deletion der äquivalenten Schleife auf der Ssp-β-Helix (Ssp-ΔL2) keine erkennbare Auswirkung auf den Eintritt in Epithelzellen. Im Vergleich dazu wurde festgestellt, dass die β-Helix von AT-Adhäsinen wie uropathogenem E. coli UpaB direkt Zelloberflächen bindet49. Die Untersuchung der Ssp-β-Helix ergab ein RGD-Motiv als mögliche Zellbindungsstelle. Leider hatte die Störung dieses Motivs keine spürbaren Auswirkungen auf die Ssp-Interaktion mit Epithelzellen. Es wurde festgestellt, dass die β-Helices anderer AT-Adhäsine wie Ag43a an der Selbstassoziation beteiligt sind, um bakterielle Phänotypen wie die Biofilmbildung zu fördern48,50. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass die Ssp-β-Helix diese Rolle spielt, da sie laut Größenausschlusschromatographie ein Monomer ist und es keine Hinweise auf eine Ssp-vermittelte Bakterienaggregation gibt (ergänzende Abbildung 7). Darüber hinaus ist bekannt, dass Ssp nicht an der Bakterienoberfläche verbleibt, sondern durch die Wirkung seiner eigenen Subtilase zusammen mit anderen Oberflächenproteasen gespalten und in die Umgebung freigesetzt wird. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir noch keine Rolle für die ungewöhnliche Ssp-β-Helix definieren müssen.

Insgesamt hat diese Struktur-/Funktionsanalyse der Subtilase Ssp wertvolle Einblicke in diese große Gruppe von ATs geliefert und einzigartige Strukturmerkmale offenbart, die weder Subtilasen noch Autotransporter gemeinsam haben und die für ihre zytotoxische Aktivität erforderlich sind. Dennoch gibt es gemeinsame Gemeinsamkeiten, die ebenfalls aufschlussreich sind. Die gemeinsame Faltung zwischen der Ssp-Subtilasedomäne und anderen Subtilasen lässt auf einen gemeinsamen Ursprung schließen. Darüber hinaus offenbart die Ssp-Architektur, die aus einer N-terminalen Protease besteht, die an eine C-terminale β-Helix gebunden ist, ein gemeinsames Gerüst, das in anderen ATs wie den (Chymo)trypsin-ähnlichen Protease-ATs beobachtet wird. Die Aufklärung der Ssp-Struktur stellt einen bedeutenden Schritt vorwärts zum Verständnis des molekularen Mechanismus dar, der der funktionellen Divergenz in der großen AT-Superfamilie zugrunde liegt. Daher wird es von großer Bedeutung sein, weitere funktionell relevante molekulare Merkmale aufzudecken, die den breiteren AT- und Enzymfamilien gemeinsam sind, da weitere ATs im molekularen Detail untersucht werden.

Das für Ssp aus IFO-304628 kodierende Gen wurde für die Expression in E. coli codonoptimiert, synthetisiert und von Invitrogen in pBAD/Myc-His-B subkloniert. Mutationen zu Ssp-pBAD wurden entweder mit der Stratagene QuikChange II-Methode mit Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase (NEB, M0491S) und DpnI (NEB, R0176S) oder dem Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (NEB, E0552S) durchgeführt. Die verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 5 und in der Liste der erzeugten Mutanten in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Erfolgreiche Mutationen wurden durch Didesoxynukleotidsequenzierung (Macrogen, Korea) verifiziert.

E. coli BL21(DE3), das das Ssp-pBAD/Myc-His-B-Plasmid beherbergt, wurde in LB, ergänzt mit 100 µg/ml Ampicillin, bei 37 °C gezüchtet. Die Expression von Ssp wurde durch Zugabe von 0,02 % L-Arabinose bei 30 °C für 4 Stunden induziert. Die Medien wurden vor der Dialyse in 20 mM Tris, pH 9,0, unter Verwendung von Crossflow-Kassetten Vivaflow 200 (Sartorius, VF20P2) bei 4 °C geerntet, filtriert und etwa 40-fach konzentriert. Das sekretierte Protein wurde durch zwei Runden Anionenaustauschchromatographie, HiTrap Q FF (GE Healthcare, 17515601) und Mono Q 10/100 GL (GE Healthcare, 17516701), mit 20 mM Tris, pH 9,0 und Elution mit 1 M NaCl gereinigt. Rekombinantes Ssp wurde durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung eines HiLoad Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, 28989335), voräquilibriert mit 25 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,0, weiter gereinigt.

Mit SeMet markiertes Ssp wurde in Minimalmedium, ergänzt mit 50 μg/ml Selenomethionin, induzierend mit 0,5 % L-Arabinose bei 20 °C über Nacht exprimiert69. Ssp-SeMet wurde wie oben beschrieben gereinigt.

Ssp-Mutanten wurden in E. coli Top10-Zellen in LB exprimiert, indem sie über Nacht bei 20 °C mit 0,2 % L-Arabinose induziert wurden. Die Medien wurden unter Verwendung einer Ultra-0,5-Zentrifugalfiltereinheit (Amicon, UFC5010BK) konzentriert. Das Protein wurde durch Densitometrie unter Verwendung von SDS-PAGE mit gereinigtem Ssp als Standard unter Verwendung von Image Lab 6.0 (Bio-Rad) quantifiziert. Ssp-ΔE2 wurde auf die gleiche Weise wie Ssp-WT gereinigt.

Die Proteaseaktivität wurde mit dem EnzChek Protease Assay Kit, grüne Fluoreszenz (Invitrogen, E6638) in 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,005 % Triton X-100, pH 7,4 mit einem FLUOstar Omega-Plattenlesegerät (BMG Labtech) bei Ex/Em 485 gemessen /520 nm. Typischerweise wurden im Assay 50 nM Ssp verwendet.

Die thermische Denaturierung von Ssp wurde in einem Agilent Cary 3500 Multicell UV-Vis-Spektrophotometer überwacht. Die thermischen Schmelzen wurden bei 20–90 °C und unter Überwachung bei 280 nm unter Verwendung von Ultramikro-Quarzküvetten mit 10 mm Weglänge (Hellman) und einer Anstiegsrate von 0,5 °C/min durchgeführt. Die Daten wurden bei einem Ssp von 0,5 mg/ml in 25 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,0 (150 μL) mit der Zugabe von entweder 10 mM EDTA, 10 mM CaCl2 oder ohne Zusatz gesammelt. Die Daten wurden an die folgende Gleichung angepasst, um die scheinbare Schmelztemperatur (Tmapp) abzuschätzen:

Wobei \({k=e}^{\left[\frac{h}{1.987\left(x+273.15\right.}\right]\left[\frac{x+273.15}{t+273.15}-1 \right]}\), y ist die Absorption, x ist die Temperatur, h ist die Enthalpie, t ist Tmapp, u ist die gefaltete Absorption, l ist die ungefaltete Absorption und u1 und l1 sind lineare Korrekturen für gefaltet bzw. entfaltet als Funktion der Temperatur .

Ssp, nativ und SeMet, wurden unter Verwendung der Dampfdiffusionsmethode mit hängenden Tropfen mit Tropfen kristallisiert, die 1 µL Proteinlösung (15 mg/ml in 25 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,0) und 1 µL Reservoirlösung (0,2 M Kalium) enthielten Jodid, 20 % (w/v) PEG 3350, 0,1 M HEPES, pH 7,0 für natives Ssp, und 0,2 M Kaliumiodid, 23 % (w/v) PEG 3350, 0,1 M HEPES, pH 6,8 für Ssp-SeMet) bei 20 °C. Kristalle erschienen innerhalb von 5 Tagen. Zur Röntgendatenerfassung wurden die Ssp-Kristalle in einer Kryoschutzmittellösung eingeweicht, die eine Reservoirlösung aus Glycerin (20 % v/v) enthielt, und direkt in flüssigem Stickstoff blitzgekühlt. Sowohl native als auch anomale Daten wurden für 360° unter Verwendung von 0,954 Å bei 100 K mit einem EIGER x 16 M-Detektor mit 0,1 Grad pro Bild und einer Belichtung von 0,02 s am australischen Synchrotron auf der MX2 Beamline70 gesammelt. Die Daten wurden mit XDS71 indiziert und integriert. Die nativen Daten wurden mit AIMLESS72 auf eine Auflösung von 2,0 Å skaliert und gehören zur Raumgruppe P1 mit Zellabmessungen von a = 47,48 Å, b = 55,36 Å, c = 61,88 Å und α = 91,52°, β = 93,04° und γ = 102,76° . Dies stimmte mit einem Molekül in der asymmetrischen Einheit überein. Die anomalen Daten von SeMet-Kristallen wurden mit BLEND73 für isomorphe Elementarzellen analysiert, wobei zwei Datensätze mit POINTLESS und AIMLESS72 zusammengeführt wurden. Alle Statistiken zur Datenerfassung und -verarbeitung finden Sie in Tabelle 1.

Die Struktur von Ssp wurde mithilfe einer Kombination aus SIRAS-Methode und MRSAD-Phasenprotokoll in der automatischen Kristallstrukturbestimmungsplattform Auto-Rickshaw74 gelöst. FA-Werte wurden mit dem Programm SHELXC75 mit dem nativen und dem zusammengeführten SeMet-Datensatz durch Kombination von isomorphen und anomalen Signalen berechnet. Mit SHELXD76 wurden insgesamt neun Selenatome pro asymmetrischer Einheit gefunden. Nach der Verfeinerung der Atome und der Änderung der Dichte wurde ein erstes Modell mit dem Programm BUCCANEER77 mit SAD-Verfeinerung erstellt und dann mit dem MRSAD-Phasenprotokoll von Auto-Rickshaw74,78 weiter verbessert. Das resultierende Modell wurde mit REFMAC579 anhand des nativen Datensatzes verfeinert und mit COOT80 weiter aufgebaut. Die Qualität des Ssp-Modells wurde von MolProbity81 bewertet. Die Statistiken von Ramachandran zeigten, dass 97 % der Rückstände in der am meisten begünstigten Region und 3 % in den zugelassenen Regionen lagen. Die Verfeinerungswerte sind in Tabelle 1 angegeben. Molekulare Zahlen wurden mit PyMOL82 erstellt. Der PDB-ID-Code lautet 8E7F.

Rinderserumalbumin (BSA) wurde von Scientifix (BSAS-0.1) bezogen. HEp-2 wurde freundlicherweise von Dr. Natalie Borg (RMIT, Australien) gespendet. HEp-2 ist eine bekannte Kontamination des menschlichen HeLa-Karzinoms. Es handelt sich um eine weit verbreitete Zelllinie in der Autotransporterforschung. Aus diesem Grund haben wir uns entschieden, die Zelllinie zu verwenden und den Verweis auf HEp-2 im Artikel aus Konsistenzgründen beizubehalten. Die Zelllinie wurde nicht authentifiziert. HEp-2-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Gibco, 11965092), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Corning, 35-076-CV) und 2 mM l-Gln (Gibco, 25030081), kultiviert. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 kultiviert und unter Verwendung von 0,25 % Trypsin-EDTA (Gibco, 25200056) geerntet. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Inkubationen bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 durchgeführt. Proteine ​​und konzentrierte Medien wurden mit Costar Spin-X-Zentrifugenröhrchenfiltern (Corning, 8161) steril filtriert, bevor sie auf die Zellen aufgetragen wurden.

HEp-2-Zellen wurden mit einer Dichte von 2000 Zellen/Well in 96-Well-Platten (Falcon, 353072) in DMEM, 5 % FBS und 2 mM l-Gln ausgesät. Die Zellen wurden 5 oder 24 Stunden lang mit Ssp behandelt. Der CyQUANT LDH-Zytotoxizitätstest (Invitrogen, C20301) wurde verwendet, um die LDH-Aktivität gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen.

Der Immunnachweis von Ssp wurde unter Verwendung von gereinigtem polyklonalem Kaninchenserum durchgeführt, das gegen gereinigten Passagier von Ssp in der Walter and Eliza Hall Antibody Facility (Australien) gezüchtet wurde. HEp-2-Zellen wurden mit einer Dichte von 2,0 × 105 Zellen/Well auf 18-mm-Deckgläsern (Marienfeld, 0117580) in 12-Well-Platten (Greiner, 665180) für die konfokale Mikroskopie oder 1,0 × 105 Zellen/Well in 24-Well-Platten (Greiner) ausgesät , 662160) für DIC-Mikroskopie in DMEM, 10 % FBS und 2 mM l-Gln. Nach der Inkubation über Nacht wurden die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und das Medium durch RPMI 1640 (Gibco, 11875093) ersetzt.

Die konfokale Mikroskopie begann mit der Zugabe von 25 μg/ml konzentrierter Überstände von Ssp-Varianten pro Vertiefung und einer Inkubation der Zellen für 5 Stunden vor dem Waschen mit PBS (diese Konzentration basiert auf den Konzentrationen, die zuvor für die Charakterisierung zytotoxischer Autotransporter verwendet wurden (30–37 μg/ mL)23,66 sowie die Ssp-Überstandskonzentration, die zuvor durch SDS-PAGE im nematiziden Serratia sp.27) nachgewiesen wurde. Bei der Vorbereitung der Objektträger wurden alle Inkubationen bei Raumtemperatur durchgeführt und nach jedem Schritt wurde mit PBS-T (PBS mit 0,05 % Tween-20) gewaschen, sofern nicht anders angegeben. Die Zellen wurden 10 Minuten lang mit 4 % Formalin/PBS fixiert, bevor sie mit PBS mit 100 mM Glycin gewaschen wurden. Die fixierten Zellen wurden mit 0,2 % Triton X-100/PBS 5 Minuten lang permeabilisiert und mit 2 % BSA/PBS 1 Stunde lang oder über Nacht bei 4 °C blockiert. Die Deckgläser wurden dann 1,25 Stunden lang mit polyklonalen Ssp-Antiseren (1:4), mit Alexa Fluor Plus 647 konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:200, Invitrogen, A32733) 1 Stunde lang und mit Phalloidin-iFluor 555-Reagenz (1:1) inkubiert. 1000, Abcam, ab176756) für 30 Minuten und DAPI (1 μg/ml, Sigma, D9542) für 5 Minuten im Dunkeln. Deckgläser wurden mit SlowFade Diamond Antifade Mountant (Invitrogen, S36972) auf Objektträger montiert und mit dem konfokalen Zeiss LSM 780-Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung abgebildet. Für den Anti-Ssp-Kanal wurde ein Z-Stapel bestehend aus 10 Scheiben von der Ober- bis zur Unterseite der Zellen erstellt und der Z-Stapel mithilfe der Summenfunktion in FIJI83 projiziert. Die Bilder wurden in FIJI83 mit dem BIOP Channel Tools-Plugin verarbeitet.

Die Differential-Interferenzkontrast-Mikroskopie (DIC) begann mit konzentrierten Überständen von Ssp-Varianten (12,5 μg, 25 μg/ml), die pro Vertiefung hinzugefügt wurden, und die Zellen wurden 30 Minuten lang inkubiert, bevor sie mit PBS gewaschen wurden. Die Zellen wurden mit dem Zeiss Axio Observer-Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung abgebildet. Die Bilder wurden in FIJI83 verarbeitet.

Galleria mellonella-Larven wurden bei 19 °C in einem Kühlbrutschrank (TRIL-495-1-SD, Thermoline Scientific) mit einer Diät aus 46 % (w/w) Farex-Mehrkorngetreide (ab 6 Monaten, Heinz), 22 % (w/w) gezüchtet. w) Glycerin (Chem-Supply), 22 % (w/w) Honig (Capilano), 7 % (w/w) entionisiertes Wasser und 3 % (w/w) Hefeextrakt (Oxoid, LP0021B).

Gruppen von sechs zufällig ausgewählten Larven (durchschnittliche Masse 165 mg) wurden mit einer 1-ml-U-100-Insulinspritze (Terumo, 29 G ×) durch das letzte rechte Vorderbein mit 20 µL der gereinigten Ssp-Variante, verdünnt in sterilem PBS, injiziert 13 mm), befestigt an einer NE-1000 Spritzenpumpe (New Era). Die inokulierten Larven wurden bei 37 °C inkubiert und die Sterblichkeit täglich bestimmt. Larven galten als tot, wenn nach einem physischen Reiz mit einer Pinzette keine Reaktion beobachtet wurde.

Die Ssp-pBAD- oder pBAD-Vektorkontrolle in E. coli Top10 wurde in LB mit 100 µg/ml Ampicillin bei 37 °C unter Schütteln kultiviert. Die Expression von Ssp wurde durch Zugabe von 0,2 % L-Arabinose bei 20 °C über Nacht induziert. Die Kultur (800 µL) wurde in Halbmikroküvetten (Greiner) gegeben und der OD600 über die Zeit bei Raumtemperatur gemessen (Molecular Devices SpectraMax M5).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in diesem Artikel beschriebenen Kristallographie-, Atomkoordinaten- und Strukturfaktoren wurden in der Proteindatenbank unter der PDB-ID 8E7F hinterlegt. Die folgenden Strukturmodelle aus der PDB wurden in dieser Studie ebenfalls verwendet: 1LW6 (Subtilisin BPN'), 5KE1 (IcsA-Autotransporter), 1GA1 (Sedolisin), 3LPC (AprV2 aus Dichelobacter nodosus), 3EIF (Streptococcus pyogenes ScpA) und 3I6S (Tomate). Subtilase). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Forschung wurde teilweise mit der MX2-Beamline am Australian Synchrotron, einem Teil von ANSTO, durchgeführt und nutzte den Detektor der Australian Cancer Research Foundation (ACRF). Die Autoren möchten Peter Lock und Chad Johnson von der La Trobe University Bioimaging Platform danken. Diese Arbeit wurde durch Projektzuschüsse des Australian Research Council (ARC) (DP150102287, DP180102987, DP210100673), Fellowship (FT130100580) und einen Projektzuschuss des National Health and Medical Research Council (NHMRC) (GNT1143638) unterstützt.

Abteilung für Biochemie und Chemie, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, Kingsbury Drive, Bundoora, VIC, 3086, Australien

Lillian Hor, Aquila Pillar, James A. McKenna, Marilyn A. Anderson, Jason J. Paxman und Begoña Heras

Australisches Synchrotron, ANSTO, Clayton, VIC, 3168, Australien

Santosh Panjikar

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Monash University, Clayton, VIC, 3800, Australien

Santosh Panjikar

INRAE, Universität Clermont Auvergne, UMR454 MEDiS, 63000, Clermont-Ferrand, Frankreich

Mickaël Desvaux

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BH, JJP und MD haben die Forschung entworfen. LH, AP und SP führten die Experimente durch. BH, JJP, LH und SP analysierten die Daten. BH, JJP, JAM und MAD überwachten Aspekte der Arbeit. Alle Autoren trugen zur Interpretation der Ergebnisse bei. LH, JJP und BH haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren trugen zur kritischen Überarbeitung des Manuskripts bei, lasen und genehmigten das endgültige Manuskript.

Korrespondenz mit Jason J. Paxman oder Begoña Heras.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Peter van Ulsen und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Hor, L., Pilapitiya, A., McKenna, JA et al. Die Kristallstruktur einer Subtilisin-ähnlichen Autotransporter-Passagierdomäne gibt Einblicke in ihre zytotoxische Funktion. Nat Commun 14, 1163 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36719-2

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Eingegangen: 05. Oktober 2022

Angenommen: 14. Februar 2023

Veröffentlicht: 01. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36719-2

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