Bestimmte Gewebenischen steuern die Immunpathologie der Lunge über CCL18 und CCL21 bei schwerem COVID

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 791 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eine anhaltende Lungenpathologie wurde mit COVID-19 in Verbindung gebracht, doch die zellulären und molekularen Mechanismen hinter dieser chronisch entzündlichen Erkrankung sind kaum verstanden. In dieser Studie kombinieren wir fortschrittliche Bildgebung und räumliche Transkriptomik, um Licht auf die lokale Immunantwort bei schwerem COVID-19 zu werfen. Wir zeigen, dass aktivierte Adventitialnischen entscheidende Mikroumgebungen sind, die zur Orchestrierung einer längeren Lungenimmunpathologie beitragen. Eine Hochregulierung der Chemokine CCL21 und CCL18 ist mit dem Übergang vom Endothel zum Mesenchym und der Gewebefibrose in diesen Nischen verbunden. Die Überexpression von CCL21 ist außerdem mit der lokalen Anhäufung von T-Zellen verbunden, die den verwandten Rezeptor CCR7 exprimieren. Diese T-Zellen weisen einen erschöpften Phänotyp auf und bilden Lymphaggregate, die sich in ektopischen Lymphstrukturen organisieren können. Unsere Arbeit schlägt immun-stromale Interaktionsmechanismen vor, die eine selbsttragende und nicht auflösende lokale Immunantwort fördern, die über eine aktive Virusinfektion hinausgeht und den Gewebeumbau aufrechterhält.

Adventitielle Nischen finden sich in der äußersten Schicht mittlerer bis großer Blutgefäße sowie um die Atemwege herum und stellen spezielle Mikroumgebungen dar, in denen Immunzellen mit Stromazellen und dem Gefäßsystem interagieren, um den Gewebestatus zu überwachen und Immunantworten zu modulieren1. COVID-19-Verläufe mit schweren histopathologischen Veränderungen und Immunzellinfiltration in der Lunge. Diese entstehen als direkte Folge einer SARS-CoV-2-Infektion2, aber auch indirekt durch eine gestörte Immunantwort3 und führen zu einem funktionellen Zusammenbruch der vaskuloepithelialen Barrieren4. In späteren Krankheitsphasen scheinen die Gewebeumbaumechanismen, die auf die Reparatur der mikroanatomischen Lungenstruktur abzielen, bei manchen Personen beeinträchtigt zu sein und führen zu Gewebevernarbungen und Lungenfibrose5, die zu chronischen Atemwegsbeschwerden und fibrotischen Erkrankungen beitragen5,6. Eine abnormale Makrophageninfiltration zusammen mit einer erhöhten Anzahl von Fibroblasten in der Lunge wurde als Kennzeichen einer schweren COVID-19-Erkrankung vorgeschlagen7,8. Darüber hinaus zeigen alternativ aktivierte Makrophagen, die sich in der COVID-19-Lunge ansammeln, eine profibrotische Signatur9, obwohl die genauen Mechanismen, wie sie die Fibrose fördern, noch geklärt werden müssen. Längere Veränderungen der Immunlandschaft der Atemwege mit einer erhöhten Anzahl zytotoxischer Lymphozyten und B-Zellen wurden kürzlich mit Folgen von COVID-19 in Verbindung gebracht10.11. Daher ist es von größter Bedeutung, die Rekrutierungswege zu beleuchten, die eine übermäßige Immuninfiltration in die Lunge vermitteln, und ihre Auswirkungen auf das Fortschreiten der Krankheit. Ob die Gewebepathologie das Ergebnis eines Virusreservoirs in Zielorganen ist oder durch einen Autoimmunmechanismus verursacht wird oder ob beide Phänomene zur Krankheit beitragen, ist Gegenstand anhaltender Diskussionen. Neben der Bedeutung der endothelialen Dysfunktion für die Pathomechanismen der COVID-19-Erkrankung12,13, wobei in jüngsten Berichten postakute, langfristige kardiovaskuläre Manifestationen14 und chronische Lungengefäßerkrankungen6 hervorgehoben werden, verdient die Adventitialnische besondere Aufmerksamkeit, um die Rolle von Immunzellen aufzuklären bei nachhaltiger Gewebeschädigung.

Hier haben wir durch die Kombination von Histopathologie, Multiplex-Histologie, Elektronenmikroskopie (EM), dreidimensionaler Lichtblattmikroskopie (LSFM), Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNASeq) und räumlicher Transkriptomik (ST) Einblicke in die Chemokin-Chemokin-Rezeptor-Wechselwirkungen gewonnen Auftreten in Lungennischen während COVID-19. Wir schlagen ein dysreguliertes immunstromales Crosstalk vor, das eine selbsttragende und nicht auflösende lokale Immunantwort fördert, die über eine aktive Virusinfektion hinausgeht. Unser einzigartiger räumlicher Ansatz identifiziert die endotheliale Dysfunktion als Auslöser von Gewebeumbauwegen in Adventitia-Nischen, die als Keimpunkte für Fibrose erscheinen. Diese Nischen entstehen als spezialisierte Mikroumgebungen, die T-Zellen mit erschöpften Profilen sowie Immunzellaggregate, die sowohl aus B- als auch T-Zellen bestehen, bei längerer COVID-19-Erkrankung beherbergen.

Um die pathophysiologischen Veränderungen zu untersuchen, die in der Lunge im Zusammenhang mit einer SARS-CoV-2-Infektion in unserer Kohorte auftreten, kombinierten wir mehrere Mikroskopietechniken und räumliche Transkriptomik (ST) in aufeinanderfolgenden Objektträgern postmortaler Lungengewebeproben, die von COVID-19 entnommen wurden Spender. Als Kontrollen wurden Lungenproben von nicht mit COVID-19 in Zusammenhang stehenden Lungenentzündungen einbezogen. Wir haben die COVID-19-Fälle in akute (1 bis 15 Tage Krankheitsdauer), chronische (mehr als 15 Tage) und verlängerte (7–15 Wochen) Fälle unterteilt (Tabelle 1). Wir haben mittelgroße bis große Gefäße, Atemwege, Alveolarräume, Immuninfiltrate und fibrotische Bereiche in mit Hämatoxylin/Eosin (HE) gefärbten Lungenschnitten kommentiert (ergänzende Abbildung 1a). Diese Anmerkungen dienten als Orientierungspunkte für die weitere räumliche Charakterisierung der lokalen Immunantwort innerhalb unterschiedlicher funktioneller Lungenmikroumgebungen. COVID-19-Lungen zeigten deutliche Veränderungen in der Gewebezusammensetzung und der mikroanatomischen Struktur, die durch die Ansammlung von Immunzellinfiltraten und fibrotischen Bereichen gekennzeichnet sind (Abb. 1a und ergänzende Abb. 1a). Diese Phänomene traten besonders in späten Krankheitsstadien auf und gipfelten in einem Mangel an Alveolarräumen. Dementsprechend zeigte die Immunfluoreszenzfärbung (IF) benachbarter Gewebeschnitte eine Anhäufung von Kollagenablagerungen und CD45+-Immunzellaggregaten in späteren Krankheitsstadien (Abb. 1b; rote Pfeile). Die ST-Analyse bestätigte die verstärkte Kollagenablagerung auf Transkriptionsebene (Abb. 1c), und die Aufnahme großer Bildvolumina mittels Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) bestätigte den Anstieg der Gewebedichte während einer längeren COVID-19-Erkrankung weiter (Abb. 1e, Ergänzungsfilm 1 und 2). Das retikuläre ER-TR7-Muster bildete in der akuten Phase ein zartes, hochstrukturiertes dreidimensionales Gerüst, während es in der verlängerten Lunge unorganisiert, dicht und kompakt erschien.

a–d Gewebeschnitte von Lungenproben eines nicht mit COVID-19 in Zusammenhang stehenden Lungenentzündungsspenders und von COVID-19-Spendern zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Krankheitsbeginn wurden mithilfe ortsaufgelöster Techniken analysiert (n = 12 Gewebeschnitte). Jede Spalte stellt eine Reihe aufeinanderfolgender Abschnitte desselben Spenders dar. Eine HE-Färbung zeigt die Gewebestruktur in ganzen Schnitten. Gepunktete Linien stellen Bereiche dar, die durch konfokale Mikroskopie (b) und durch räumliche Transkriptomik (ST; c) analysiert wurden. Kleine Quadrate stellen Bereiche dar, die mittels Multiplex-Mikroskopie analysiert wurden (d). b Entsprechende Immunfluoreszenzbilder (IF), die CD45 in Gelb, DAPI in Magenta, Collagen I (Col.I) in Cyan und Collagen IV (Col.IV) in Blau zeigen. c Relative Expression von COL1A1, dargestellt als Log2-fache Änderung zwischen dem 5. und dem 95. Quantil und angezeigt auf den Spots, analysiert durch ST. d Entsprechende IF-Bilder, die DAPI in Magenta, CD45 in Gelb und Collagen IV in Cyan zeigen. e Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM)-Aufnahme einer akuten und einer länger andauernden COVID-19-Lungenprobe, gefärbt mit dem Fibroblastenmarker ER-TR7 (gelb) (n = 4 Proben). Siehe auch Zusatzfilm 1 und 2. Punktdiagramm, das die absoluten Zellzahlen (f) und CD45+-Zellzahlen (g) pro Sichtfeld (FOV) darstellt, die 665 × 665 µm darstellen, analysiert durch Multiplex-Mikroskopie. Die Daten (M ± SD) werden durch einfaktorielle ANOVA mit Fisher-LSD-Test analysiert, F (3, 28) = 5,09, p = 0,006 (f) und F (3, 28) = 3,391, p = 0,03 ( G). Verschiedene ausgefüllte Symbole repräsentieren unterschiedliche Spender. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. (d, f und g) (n = 32 FOVs). Siehe auch Ergänzende Abbildungen. 1 und 2.

Wir analysierten dieselben Lungen mittels Multi-Epitop-Liganden-Kartographie (MELC) 15, 16, einer Multiplex-Mikroskopietechnik, die es uns ermöglichte, ein 44-Parameter-Panel für die Immunfluoreszenzhistologie anzuwenden (Abb. 1d und ergänzende Abb. 1b). Wir haben die Multiplex-Mikroskopie-Immunfluoreszenzbilder vorverarbeitet und segmentiert, um quantitative Informationen über die Gewebezusammensetzung auf Einzelzellebene zu erhalten17. Die Gesamtzellzahl und die CD45+-Zellzahl stiegen in der Gruppe mit verlängerter COVID-19-Erkrankung deutlich an (Abb. 1f, g). Bemerkenswerterweise hatten Personen in dieser Gruppe die Infektion abgeheilt und Lungenproben wurden negativ getestet oder wiesen laut qPCR nur eine sehr geringe RNA-Belastung auf, die auf das SARS-CoV-2 E-Gen abzielte. Für die aktive Virusreplikation wurde subgenomische RNA (sgRNA) als Ersatz verwendet und wir erhielten negative Ergebnisse für alle analysierten chronischen und verlängerten Lungengewebe. Allerdings zeigten sowohl chronische als auch langanhaltende Fälle eine verschlimmerte Lungenschädigung und höhere histopathologische Fibrosewerte basierend auf der HE/Elastica van Gieson (EvG)-Färbung (Tabelle 1), was sich in einer positiven Korrelation zur Probenstratifizierung widerspiegelt. Im Gegenteil, diagnostizierte bakterielle Pneumonie und akutes Atemnotsyndrom (ARDS) korrelierten weder mit dem Fibrose-Score noch mit der Krankheitsgruppe (ergänzende Abbildung 1c), im Einklang mit einer aktuellen Übersicht, die berichtet, dass eine interstitielle Lungenerkrankung nach COVID-19 vorliegt entwickelt sich unabhängig von ARDS während der akuten Phase und kann als neue fibroinflammatorische Krankheitsentität verstanden werden18.

Somit zeigen diese Daten, dass ein schwerer Verlauf der COVID-19-Erkrankung durch Lungenfibrose gekennzeichnet ist und dass es in längeren Fällen unabhängig von einer aktiven Virusinfektion zu einer deutlichen Ansammlung von Immunzellen kommt.

Als nächstes wollten wir den strukturellen Lungenschaden weiter charakterisieren. Im Einklang mit früheren Studien beobachteten wir eine drastische Lungenvaskulopathie bei schwerer COVID-19-Erkrankung4,13. In unseren Proben zeigte sich der Zusammenbruch der Endothelbarriere durch das Fehlen einer CD31-Färbung in 5 von 8 Sichtfeldern (FOVs), die in der akuten Lunge analysiert wurden, und zeigte in späteren Krankheitsphasen ein abweichendes Muster (Abb. 2a). Im Einklang mit früheren Berichten, die auf einen Fehler beim Umbau des Alveolarepithels nach einer SARS-CoV-2-Infektion2,4 hinweisen, beobachteten wir ein Fehlen der prototypischen Monoschichtstruktur in der Panzytokeratin (PCK)-Färbung (Abb. 2a). Als Hinweis auf eine Lungenfibrose nahmen die Signale von Aktin der glatten Muskulatur (αSMA) und des retikulären Fibroblastenmarkers ER-TR7 mit der Krankheitsdauer zu (Abb. 2a). Darüber hinaus ergab die rechnerische Analyse der Multiplex-Mikroskopie-Bilddaten (ergänzende Abbildung 2a – c), dass die absolute Anzahl von Endothelien, Epithelien und Fibroblasten in den längeren Proben erhöht war, was auf Wiederherstellungsversuche hindeutet, insbesondere innerhalb des Endothelkompartiments, wo die Die Unterschiede waren ausgeprägter (Abb. 2b).

a Multiplex-Mikroskopie-Immunfluoreszenzbilder (IF), die Aktin der glatten Muskulatur (αSMA) in Blau, CD31 in Cyan, Pancytokeratin (PCK) in Magenta und ER-TR7 in Gelb in einem repräsentativen Sichtfeld (FOV) im Lungengewebe für jede Krankheitsgruppe darstellen . b Punktdiagramm der absoluten Zellzahlen pro FOV von Endothelzellen, Epithelzellen und Fibroblasten in jeder Krankheitsgruppe. Verschiedene ausgefüllte Symbole repräsentieren unterschiedliche Spender. Die Daten (M ± SD) werden durch eine Zwei-Wege-ANOVA mit dem Fisher-LSD-Test analysiert, F (3, 84) = 8,124, p ˂ 0,0001. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. (a, b) (n = 32 FOVs). Siehe auch Ergänzende Abbildungen. 1B und 2A–C. c Das Ultrastrukturbild des Autopsie-Lungengewebes eines akuten Spenders zeigt ein großes Gefäß mit mehreren abgelösten Endothelzellen in seinem Lumen (weiße Sterne). Der digital vergrößerte Bereich des umrahmten Bereichs zeigt eine sich ablösende Endothelzelle. (n = 6 akute Lungenproben). d Heatmap-Anzeige des durchschnittlichen Expressionsniveaus mehrerer Endothel-bezogener Transkripte für alle Proben in jeder Krankheitsgruppe, analysiert durch räumliche Transkriptomik (ST) (n = 12 Gewebeschnitte). e Orthogonaler Schnitt einer Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM)-Aufnahme einer akuten COVID-19-Lungenprobe, gefärbt mit ER-TR7 (gelb). Gewebeautofluoreszenz (Magenta) ermöglicht die Visualisierung eines großen Gefäßes mit einem an der Gefäßwand befestigten Makrothrombus (Gelb und Magenta). (n = 4 Proben). Siehe auch Zusatzfilm 3.

In Übereinstimmung mit dem Verlust von CD31 in akut infizierten Lungen beobachteten wir durch Elektronenmikroskopie mehrere Gefäße mit Ablösung von Endothelzellen (Abb. 2c) und eine Herunterregulierung mehrerer endothelbezogener Transkripte, einschließlich PECAM1, in derselben Krankheitsgruppe (Abb. 2d). ). Die Vaskulopathie war auch mit einer ausgeprägten Koagulopathie und thrombotischen Ereignissen verbunden (Abb. 2e, Zusatzfilm 3). Trotz aller Bemühungen, einschließlich ultrastruktureller (ergänzende Abbildung 3d) und immunhistochemischer Analysen (ergänzende Abbildung 3e) gemäß Best-Practice-Standards19, konnten wir keine ausreichenden Anzeichen einer pulmonalen endothelialen SARS-CoV-2-Infektion finden, was die beobachtete umfangreiche endotheliale Dysfunktion erklärt. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass die Störung der Endothelbarriere, ein herausragendes Merkmal schwerer akuter COVID-19-Erkrankungen, eine indirekte Auswirkung der SARS-CoV-2-Infektion ist, die in späteren Krankheitsphasen wiederhergestellt werden muss.

Um die Mechanismen zu verstehen, die den funktionellen Veränderungen im Stroma-, Epithel- und Gefäßkompartiment zugrunde liegen, führten wir eine Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) durch. Mehrere Wege im Zusammenhang mit der Aktivierung und dem Umbau des Endothels, zusammen mit dem Übergang vom Epithel zum Mesenchym, der Kollagenbiosynthese und kollagenmodifizierenden Enzymen, wurden bei COVID-19 in der Lunge induziert, insbesondere in der verlängerten Phase (Abb. 3a). Darüber hinaus ergaben die Dimensionsreduktion und die unbeaufsichtigte Clusteranalyse der ST-Daten 9 Punktcluster, die diskrete Lungenmikroumgebungen mit unterschiedlichen Transkriptionssignaturen darstellten, die auf Endothelien (C3 und C8), Epithelien (C0 und C6), Stroma (C2 und C5) oder unterschiedliche Transkriptionssignaturen hinweisen Immunlinien (C1: Makrophagen und C4: Plasmazellen) (Abb. 3b). Die Cluster wurden im UMAP-Raum visualisiert und die 25 wichtigsten differentiell exprimierten Gene (DEG) wurden auf einer Heatmap angezeigt (ergänzende Abbildung 3a – c). C5 war durch Transkripte im Zusammenhang mit Kontraktilität und Umlagerungen des Zytoskeletts gekennzeichnet und wurde mittleren bis großen Gefäßmarkierungen und Bronchien zugeordnet (Abb. 3c und ergänzende Abb. 3d), was auf die Identität von Myofibroblasten schließen lässt. Das endotheliale C8 war räumlich um diese Orientierungspunkte herum verteilt und grenzte an C5 an. C8 zeigte eine hohe Expression von CCL21, einem Chemokin, das in akuten COVID-19-Proben kaum nachweisbar war, in späteren Krankheitsphasen jedoch stark hochreguliert war (ergänzende Abbildung 3e). Darüber hinaus wurde C8 mit komplementbezogenen Transkripten und PTX3 angereichert, das für TNF-α-induziertes Protein 5 kodiert (Abb. 3b und ergänzende Abb. 3c). Dieses Protein fördert die Differenzierung von Fibroblasten20 und ist an der Komplementaktivierung, Angiogenese und Gewebeumgestaltung beteiligt21. Tatsächlich überlappten diese Regionen kontraktiler Strukturen (C5) und aktivierter Endothelien (C8) räumlich mit Bereichen, in denen der Blutgefäßumbauweg angereichert war (Abb. 3c und ergänzende Abb. 3d). Daher werden sie im Folgenden als aktivierte Adventivnischen bezeichnet. Der Makrophagencluster C1 war räumlich nicht auf infiltrierte Bronchien beschränkt, sondern grenzte auch an diese aktivierten Adventitialbereiche (Abb. 3c und ergänzende Abb. 3d). Die mit C1 assoziierte Makrophagen-Transkriptionssignatur ging zusammen mit der CD163-Expression von einer hohen FTL-Expression einher. Ersteres hängt mit der Speicherung von Eisen in löslichem Zustand zusammen, letzteres kodiert für den Häm-Scavenger-Rezeptor (Abb. 3b) und wurde kürzlich mit Lungenfibrose bei schwerem COVID-199 in Verbindung gebracht. Wir haben auch einen Anstieg der Fe3+-positiven Zellen durch Berliner Blaufärbung zusammen mit der Krankheitsdauer festgestellt (Tabelle 1), was auf ein Austreten von Plasma aus zerstörten Gefäßen in das Gewebe hinweist. Neben seiner Häm-abfangenden Signatur war C1 mit CCL18 angereichert (Abb. 3b und ergänzende Abb. 3c), einem Chemokin, von dem bekannt ist, dass es von alternativ aktivierten Makrophagen produziert wird und bei idiopathischer Lungenfibrose (IPF) durch Übersprechen mit Fibroblasten eine Fibrose induziert. Daten zur Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNAseq), die von einigen derselben Proben und Spender erhalten wurden (Tabelle 1)23, bestätigten, dass CD163+-Makrophagen in COVID-19 die zelluläre Quelle von CCL18 sind (ergänzende Abbildung 3f). Die Makrophagenpopulation regulierte CD163 in der COVID-19-Lunge im Vergleich zu den Kontrollen hoch und zeigte eine Anreicherung der CCL18-Expression in späteren Krankheitsphasen im Vergleich zur akuten Lunge. Durch die Verknüpfung von CD163, CCL18 und Gewebefibrose zeigte C2, das eine klare fibrotische Signatur aufwies, eine räumliche Verteilung ähnlich wie C1 im Lungenparenchym. Konsequenterweise überlappten der Weg der Kollagenbiosynthese und der modifizierenden Enzyme zusätzlich zu den aktivierten Adventitialnischen auch C1 und C2 (Abb. 3c und ergänzende Abb. 3d). Im Gegensatz dazu zeigten epitheliales C0 und C6 ein sehr deutliches Lokalisierungsmuster. Wir fanden mikroanatomische Lungenbereiche, die im Übergangsweg vom Epithel zum Mesenchym (EMT) angereichert waren und nicht räumlich mit den Epithel-C0 und C6, sondern mit den Adventitia-C5 und C8 überlappten. Dies legt nahe, dass Gewebefibrose nicht nur durch epithelialen Umbau entsteht, sondern auch durch die aktivierten Adventitialnischen mit einer CCL21-Signatur. Daher handelt es sich wahrscheinlich auch um einen Übergang vom Endothel zum Mesenchym (EndMT). Mehrere Fibrose-assoziierte Gene wie COL1A1, COL3A1 und COL4A1, die Fibroblasten-bezogenen Transkripte ACTA2, PDGFRA und CTHRC1 und der profibrotische Mediator TGF-β wurden im Gewebe der späten COVID-19-Krankheitsphasen hochreguliert (ergänzende Abbildung 3e). .

ein Punktdiagramm, das die normalisierten Anreicherungswerte (NES) und den Prozentsatz der Flecken unter dem Gewebe darstellt, die relevante Transkriptionswege für jede Krankheitsgruppe exprimieren, wie durch eine Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) von Daten der räumlichen Transkriptomik (ST) analysiert. Gezeigt werden Koagulation, Angiogenese und Übergang vom Epithel zum Mesenchym (Hallmark), Aktivierung von C3 und C5, Abfangen von Häm aus Plasma und Kollagenbiosynthese sowie modifizierende Enzyme (Reaktom) und Blutgefäßumbau (GOBP) (n = 12 Gewebeschnitte). b Punktdiagramm, das das NES und den Prozentsatz der Expression mehrerer relevanter Transkripte unter den 25 wichtigsten differentiell exprimierten Genen (DEG) innerhalb jedes ST-Clusters darstellt, wie in der ergänzenden Abbildung 3A – C dargestellt. c Farbcodierte Gewebeflecken aus einem beispielhaften Gewebeabschnitt eines durch ST analysierten COVID-19-Langzeitfalls zeigen die räumliche Verteilung relevanter ST-Cluster, wie in (b) und der ergänzenden Abbildung 3a–c gezeigt, sowie die NES aus dem Blut Gefäßumbauweg (GOBP), Kollagenbiosynthese und modifizierende Enzyme (Reaktom) und Übergang vom Epithel zum Mesenchym (Hallmark). Anmerkungen zu mittelgroßen bis großen Gefäßen (gelb) und Atemwegen (schwarz) werden als Umrisse dieser Gewebemarkierungen angezeigt. Siehe auch ergänzende Abbildung 3d. d Multiplex-Mikroskopie-Immunfluoreszenz (IF)-Overlay mit Darstellung von αSMA (blau), CCR8 (cyan), CCR7 (gelb), ER-TR7 (magenta) und CD31 (rot) in einer COVID-19-Lungenprobe. Die einzelnen Kanäle für jede extrazelluläre Färbung werden zusammen mit DAPI (weiß) für einen interessierenden Bereich angezeigt, wobei der Maßstabsbalken = 40 µm (n = 8 FOVs) ist. Grüne Pfeile zeigen CD31+SMA+ER-TR7+/--Zellen und orange Pfeile CCR8+CCR7+SMA+ER-TR7+-Zellen. (a–c) (n = 12 Gewebeschnitte).

Als nächstes stellten wir die Frage, ob das aktivierte Gefäßsystem tatsächlich in der Lage war, auf das CCL18-Signal über den verwandten Rezeptor CCR824 sowie auf CCL21 über CCR7 zu reagieren. Wir haben tatsächlich eine starke CCR8- und CCR7-Expression in SMA+- und ER-TR7+-Fibroblasten festgestellt, die große Gefäße mit zerstörten Endothelien auskleiden (Abb. 3d, orangefarbene Pfeile). Darüber hinaus waren mehrere Zellen der Gefäßwand sowohl für endotheliale als auch mesenchymale Marker positiv, CD31 und SMA und/oder ER-TR7, ein weiteres Zeichen von EndMT (Abb. 3d, grüne Pfeile)25,26,27. Obwohl diese Stromazellen die Hauptuntergruppe waren, die CCR8 in der COVID-19-Lunge exprimierte, war das CCR7-Signal nicht auf das Stromakompartiment beschränkt. Stattdessen wurde es auch in Zellen mit hämatopoetischer Morphologie beobachtet (Abb. 3d).

Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass mit CCL21 angereicherte, aktivierte Adventitialnischen mit einer EndMT-Signatur als Keimpunkte für Gewebefibrose fungieren, was mit dem Vorhandensein von CCL18+-Häm-abfangenden Makrophagen zusammenhängt.

Als nächstes wollten wir die hämatopoetischen Zellen, die CCR7 in der COVID-19-Lunge exprimieren, weiter charakterisieren. Wir haben eine breite CCR7- und PD1-Expression in großen T-Zellclustern festgestellt, die in bestimmten Adventitialnischen in Lungenproben der verlängerten Gruppe auftreten (Abb. 4a, ergänzende Abb. 4a). Einige dieser Zellen exprimierten den Proliferationsmarker Ki67 (Abb. 4a und ergänzende Abb. 4a; Pfeile). Solche T-Zell-Aggregate wurden in 7 von 12 FOVs der mittels Multiplex-Mikroskopie analysierten verlängerten Lungenproben gefunden. Sowohl die CD4+- als auch die CD8+-T-Zellzahl war in der verlängerten Lunge zusammen mit den NK-Zellen signifikant angereichert (ergänzende Abbildungen 2a – c und Abbildung 4b). LSFM von COVID-19-Lungen bestätigten den Anstieg von CD3+ T-Zellen mit der Krankheitsdauer im dreidimensionalen Raum (Zusatzfilm 4 und 5).

Eine Immunfluoreszenz (IF)-Überlagerung zeigt CCR7 (gelb), CD3 (cyan), αSMA (blau) und CD31 (magenta) in einer verlängerten COVID-19-Lunge. Das weiße Quadrat stellt die Region of Interest (ROI) dar, in der vergrößerte Einzelkanäle zusammen mit PD1, Ki67 und DAPI (n = 8 FOVs) angezeigt werden. Siehe auch ergänzende Abbildung 4a. b Dot-Plot-Darstellung der absoluten Anzahl von CD4+- und CD8+-T-Zellen und NK-Zellen, analysiert durch Multiplex-Mikroskopie. Die Daten (M ± SD) werden durch eine Zwei-Wege-ANOVA mit dem Fisher-LSD-Test analysiert, F (3, 84) = 29,56, p ˂ 0,0001. Siehe auch ergänzende Abbildungen 2a–c, ergänzende Filme 4 und 5. c Punktdiagramm, das die Proteinexpression von CD4+- und CD8+-T-Zellen in Lungen und Lymphknoten von COVID-19-Spendern und -Kontrollen zeigt. Der Farbcode gibt die durchschnittliche mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für jeden Marker an und die Punktgröße gibt den ausgedrückten Prozentsatz an. d Violindiagramme zeigen das Expressionsniveau relevanter Marker in CD4+- und CD8+-T-Zellen in Lymphknoten und Lungen für jede Krankheitsgruppe. Siehe auch ergänzende Abbildung 4A–C. c–d (n = 41 FOVs). e Violindiagramme zeigen das Expressionsniveau relevanter Marker in myeloischen Zellen von Lymphknoten für jede Krankheitsgruppe. Siehe auch ergänzende Abbildung 4c. (n = 9 FOVs). d–e Daten analysiert durch einfache ANOVA mit Wilcoxon-Test, Vergleich jeder Gruppe mit der verlängerten Gruppe, wobei * p ˂ 0,05, ** p ˂ 0,01, *** p ˂ 0,001 und **** p ˂ 0,0001. f IF-Overlays zeigen DAPI (blau), HLA-DR-DQ (cyan), CD3 (magenta) und CD141 (gelb) in einem Kontroll- und einem chronischen Lymphknoten. Das weiße Quadrat stellt den ROI dar, wobei orangefarbene Pfeile direkte Zellkontakte zwischen T-Zellen und CD141+HLA-DR-DQ+ dendritischen Zellen anzeigen. Maßstabsleiste: 20 µm (n = 9 FOVs). g Heatmap-Anzeige (Z-Score) des MFI für jeden Marker von CD4+- und CD8+-T-Zellen in perivaskulären und epithelialen Nischen der Lunge in der verlängerten Gruppe, analysiert durch Multiplex-Mikroskopie. (n = 32 FOVs). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Siehe auch Ergänzende Abbildungen. 2a–c und 4a.

Da CCL21 und sein Rezeptor CCR7 die Migration und Ansiedlung von T-Zellen in Lymphgewebe, aber auch die Rekrutierung aktivierter T-Zellen in die Lunge unterstützen28, wollten wir die lokale T-Zell-Reaktion an der Effektorstelle mit der der paarigen Drainage-Lymphknoten vergleichen ( dLNs) (siehe Tabelle 1 für analysierte Paarorgane; Abb. 4c, ergänzende Abb. 2a – c und ergänzende Abb. 4a – c). Die CD4+-T-Zellpopulation aus COVID-19-Lungen zeigte eine höhere Expression von CD8 und zytotoxizitätsbezogenen Markern. Das Kennzeichen sowohl der CD4+- als auch der CD8+-T-Zellen in der COVID-19-Lunge war die breite PD1-Expression zusammen mit CD16 (Abb. 4a, c und ergänzende Abb. 4a). Während ersterer als prototypischer Erschöpfungsmarker gilt, handelt es sich bei letzterem um einen Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitätsrezeptor. Im Gegensatz dazu zeigten beide T-Zellpopulationen in den gepaarten COVID-19-dLNs klassische Aktivierungsmarker wie CD69, HLA-DR-DQ, ICOS und Ki67. Das Expressionsniveau von CD16 und PD1 stieg mit der Krankheitsdauer sowohl in CD4+- als auch in CD8+-T-Zellpopulationen aus der Lunge an, ähnlich wie bei CD57, einem weiteren Erschöpfungsmarker. Parallel dazu nahm auch die Expression von Aktivierungsmarkern in den dLN-Gegenstücken zu (Abb. 4d). Die Hochregulierung der T-Zell-Aktivierung in sekundären lymphatischen Organen in späteren Phasen von COVID-19 spiegelte den Anstieg der CD141- und HLA-DR-DQ-Expression innerhalb der myeloischen Population des dLN wider (Abb. 4e, f und ergänzende Abb. 4c, d). . Chronische und verlängerte COVID-19-dLNs zeigten reichlich CD141+HLADR-DQ+/- dendritische Zellen (DCs) in den T-Zellbereichen, wo mehrere direkte T-DC-Kontakte beobachtet werden konnten (Abb. 4f, orangefarbene Pfeile). Bemerkenswert ist, dass die dLNs wie in der Lunge keine Anzeichen einer aktiven Virusinfektion zeigten (Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass eine anhaltende T-Zell-Aktivierung innerhalb der dLNs auftrat, nachdem die Infektion abgeklungen war.

Schließlich und basierend auf dem Vorkommen von T-Zell-Aggregaten in Adventitia-Nischen in der verlängerten COVID-19-Lunge verglichen wir das Expressionsprofil von T-Zellen in bestimmten Lungennischen innerhalb dieser Proben (Abb. 4g). Wir beobachteten die höchste Expression von CD16, PD1 und dem Proliferationsmarker Ki67 in der CD4+-T-Zellpopulation innerhalb der Adventitialnische im Vergleich zu ihren Gegenstücken in der Epithelnische. Die Koexpression dieser Marker wurde auf Einzelzellebene innerhalb dieser Bereiche bestätigt, zusammen mit der variablen Expression von Aktivierungs- und/oder Funktionsmarkern (ergänzende Abbildung 4a). Ähnliche Eigenschaften wurden kürzlich für Vorläuferpopulationen erschöpfter T-Zellen (TPEX) im Zusammenhang mit chronischen Virusinfektionen beschrieben, wo sie die virale Clearance und Immunpathologie ausgleichen sollen29,30.

Während die T-Zell-Aktivierung in den drainierenden Lymphknoten anhält, aggregieren CCL21-angereicherte Adventitia-Nischen in der Lunge in verlängerten COVID-19-Wirts-T-Zellen mit einem erschöpften Phänotyp, was auf eine lokale Prägung der Immunantwort schließen lässt.

Einige der großen Immunzellaggregate, die in den verlängerten Lungenproben beobachtet wurden, schienen besonders dicht gepackt zu sein, waren mit Kollagen+-Strukturen im Adventitiaraum assoziiert und waren manchmal direkt an den Bronchien befestigt (Abb. 5a und ergänzende Abb. 5b). Die ST-Analyse ergab einen einzigartigen Transkriptionsfingerabdruck innerhalb des Bereichs, in dem sich CD45+-Zellen befanden (Abb. 5a, b). In Übereinstimmung mit unseren Multiplex-Mikroskopie-Ergebnissen sammelten sich in diesem Bereich TPEX-bezogene Transkripte wie CD3D, TCF7 und SELL an. CCL19, CCL21, LTB und CXCL13 sind Zytokine, die eine entscheidende Rolle bei der Organisation der dort kolokalisierten lymphoiden Strukturen31 spielen. Entlang dieser Linie akkumulierte dort der B-Zell-Masterregulator PAX5 zusammen mit CCR6 stark, was mit der B-Zell-Aktivierung und der Gedächtnisbildung in Zusammenhang steht32,33. Andererseits wurden die Immunglobulin-Transkripte IGHG1, IGHD, IGHA1 und IGHM deutlich in den Atemwegen umgebenden Regionen exprimiert, und im Lymphaggregat wurden geringere Mengen an IGHD, IGHA1 und IGHM gefunden (ergänzende Abbildung 5a). Während IGHA1 in allen analysierten Lungenproben zuverlässig nachgewiesen wurde, fehlten IGHA2-Transkripte größtenteils, in Übereinstimmung mit veröffentlichten Daten aus Blut34 und Lunge35. HLA-DRA- und MKI67-Transkripte wurden im gesamten Gewebeschnitt breiter exprimiert, waren aber auch in dieser Region angereichert, was auf das Auftreten einer Antigenpräsentation und -proliferation hinweist (ergänzende Abbildung 5a). Bemerkenswert ist, dass makrophagenbezogene Transkripte wie MARCO und IL1B nicht im mit Lymphozyten angereicherten Bereich, sondern innerhalb der Atemwegsstrukturen exprimiert wurden (ergänzende Abbildung 5a). Ähnliche große, dichte und strukturierte Immunzellaggregate, die denselben einzigartigen Transkriptionsfingerabdruck aufweisen, der an ektopische lymphatische Strukturen erinnert, konnten in 2 von 3 verlängerten Lungen beobachtet werden, die mittels ST analysiert wurden (ergänzende Abbildung 5b, c). Darüber hinaus wurden in einem anderen längeren Fall kleinere Lymphaggregate gefunden, die sowohl Pax5+-B-Zellen als auch CD4+-T-Zellen in Verbindung mit PNAd+-Venolen mit hohem Endothelwert enthielten (Abb. 5c). Konsistent beobachteten wir auch einen signifikanten Anstieg der absoluten Anzahl von B-Zellen und Plasmazellen in der Gruppe mit verlängerter COVID-19-Erkrankung im Vergleich zu Kontrollgeweben und zu früheren Krankheitsstadien (Abb. 5d). Das Auftreten großer Lymphaggregate korrelierte mit der Spenderschichtung und dem Fibrose-Score, jedoch nicht mit anderen klinischen Merkmalen, was ihr Auftreten mit dem Fortschreiten der Krankheit und den aktivierten Adventitia-Nischen in Verbindung brachte (Abb. 5e).

ein Immunfluoreszenzbild (IF), das CD45 (gelb), DAPI (magenta), Kollagen IV (cyan) und Kollagen I (blau) zeigt. Das weiße Quadrat stellt eine Region of Interest (ROI) dar, die als Vergrößerung dargestellt ist und einen stark infiltrierten Bronchus mit einem dichten Immunzellaggregat daneben in der unteren linken Ecke darstellt. b Die räumliche Verteilung ektopischer lymphoider Struktur-bezogener Transkripte wird farbcodiert als normalisierte Anreicherungswerte (NES) in Überlagerung mit relevanten Gewebemarkierungen dargestellt: mittlere bis große Gefäße (gelbe Linie), Atemwegsstrukturen (schwarze Linie) und lymphatische Struktur (orangefarbene Linie). a, b (n = 2 verlängerte Lungenproben). Siehe auch ergänzende Abb. 5. c IF-Bilder aus demselben Bereich einer verlängerten Lunge, wobei DAPI (blau), CD3 (rot), PNAd (grün) und Kollagen IV (Spalte IV, weiß) im linken Bereich dargestellt sind , während DAPI (blau), Pax5 (magenta) und CD4 (cyan) rechts dargestellt sind (n = 9 FOVs). d Dot-Plot-Darstellung der absoluten Anzahl von B-Zellen/Plasmazellen pro Sichtfeld, analysiert durch Multiplex-Mikroskopie. Die Daten (M ± SD) werden durch einfaktorielle ANOVA mit Fisher-LSD-Test analysiert, F (3, 28) = 8,332, p = 0,0004 (n = 32 FOVs). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Siehe auch ergänzende Abbildung 2a–c. e Heatmap-Darstellung der Korrelation zwischen relevanten klinischen Parametern, Spenderstratifizierung und Fibrose-Score bei Vorhandensein großer Immunaggregate. Siehe auch ergänzende Abbildung 1c. Pearson-r-Werte werden im Diagramm mit zusätzlichem Farbcode für positive (blau) oder negative (rot) Korrelationen angezeigt. Die statistische Signifikanz (zweiseitig) wird mit * für p = 0,039 und ** für p = 0,007 dargestellt.

Insgesamt deuten unsere Daten darauf hin, dass aktivierte Adventitialnischen spezialisierte Mikroumgebungen sind, die die Bildung ektopischer lymphoider Strukturen in verlängerten COVID-19-Lungen unterstützen.

Die Pathomechanismen hinter einer anhaltenden COVID-19-Erkrankung sind nicht vollständig verstanden, obwohl die Folgen für viele Menschen eine Herausforderung darstellen. In dieser Studie stratifizieren wir die Proben nach Krankheitsdauer und schließen eine längere Gruppe (7–15 Wochen Krankheitsdauer nach der Infektion) ein, in der weder in der Lunge noch in den LNs über eine aktive Virusinfektion berichtet werden konnte. Dennoch zeigten diese Personen eine verstärkte Lungenschädigung sowie eine Zunahme der Lymphozyteninfiltration.

Durch die Kombination fortschrittlicher Mikroskopie-Ansätze in Verbindung mit rechnergestützter Einzelzellanalyse und ST-Techniken in Autopsiegeweben haben wir die Adventitia-Nische als einen Ort abgegrenzt, an dem eine fehlregulierte Immunantwort bei längerer COVID-19-Erkrankung zu einer Gewebeumgestaltung führt. Im Einklang mit der Vorstellung, dass die endotheliale Dysfunktion ein zentraler pathologischer Mechanismus bei COVID-19 ist12,13 und dass Endothelzellen wichtige Teilnehmer und Regulatoren von Entzündungsreaktionen sind36, schlagen wir den Übergang vom Endothel zum Mesenchym (EndMT) als Mechanismus vor, der die Fibrose vorantreibt. Wenn aktivierte Endothelzellen einer EndMT unterzogen werden, werden sie transkriptionell umprogrammiert, ihre engen Zellverbindungen werden unterbrochen und sie verwandeln sich in fibroblastenähnliche Zellen. Infolgedessen verlieren sie die Expression von Zelladhäsionsproteinen wie CD31, während mesenchymspezifische Faktoren, einschließlich α-SMA, hochreguliert werden37. Alle diese Merkmale sind in unseren Proben erkennbar (Abb. 2a, c und d, 3c, d, ergänzende Abb. 3c, d und 4a). Darüber hinaus stellen wir fest, dass Fibroblasten in Adventitialnischen der Lunge von COVID-19 den Chemokinrezeptor CCR8 exprimieren (Abb. 3d). Sein Ligand, CCL18, wurde bereits mit Lungenentzündung und -fibrose in Verbindung gebracht38 und ist der Biomarker, der am häufigsten mit negativen Ergebnissen bei IPF in Verbindung gebracht wird39. Zuvor wurde berichtet, dass CCL18 in myeloischen SARS-CoV-2-RNA+-Zellen in der Lunge von an COVID-19 verstorbenen Personen angereichert ist2. Wir haben kürzlich gezeigt, dass sich alternativ aktivierte, profibrotische Makrophagen in fibrotischen COVID-19-Lungen ansammeln9. In dieser Studie zeigen wir, dass sich in der COVID-19-Lunge ansammelnde CD163+-Makrophagen CCL18 produzieren und dieses Chemokin räumlich den fibrotischen Flecken zuordnen (Abb. 3c und ergänzende Abb. 3d). Neben der bekannten profibrotischen Funktion von CCL18 wurde kürzlich gezeigt, dass dieses Chemokin als zelleigener Faktor wirkt und die Langlebigkeit von geweberesidenten Makrophagen bei chronischen Entzündungen fördert40. Eine durch Fibrose induzierte veränderte Gewebebiomechanik kann sich weiter auf die Lokalisierung und Funktion von Immunzellen an diesen Stellen auswirken41.

Unsere Ergebnisse zeigen auch eine Anreicherung von CCL21 bei länger andauernder COVID-19-Erkrankung (ergänzende Abbildung 3f), die räumlich auf aktivierte Adventitiaräume mit anhaltender EndMT beschränkt ist (Abb. 3c). Es wurde festgestellt, dass hohe CCL21-Spiegel mit einer anhaltenden Lungenfunktionsstörung für mindestens drei Monate nach der Krankenhauseinweisung mit COVID-1942 verbunden sind. CCR7, der Rezeptor für CCL21, wird im Gegensatz zu normalen Lungenfibroblasten von IPF-Fibroblasten exprimiert, und von CCR7+ IPF abgeleitete Fibroblasten reagieren auf CCL21 mit Aktivierung, Migration, Überleben und Proliferation43,44. Wir zeigen hier, dass Myofibroblasten in COVID-19-Lungen auch CCR7 exprimieren (Abb. 3d) und somit auf die erhöhten CCL21-Signale in den Adventitia-Nischen reagieren können, insbesondere in der verlängerten Krankheitsphase. Andererseits ist CCL21 für seine Rolle bei der Rekrutierung von CCR7+-T-Zellen in sekundäre lymphatische Organe bekannt, um die adaptive Immunantwort zu organisieren45,46. Die Expression von CCL21 ist auch für die Rekrutierung von Effektor-T-Zellen in die Lunge von wesentlicher Bedeutung28. Dementsprechend zeigen unsere Ergebnisse eine breite Expression von CCR7 innerhalb der T-Zellpopulation in der Lunge von länger andauernder COVID-19-Erkrankung, wobei die absolute Zahl sowohl der CD4+- als auch der CD8+-T-Zellen im Vergleich zu allen anderen analysierten Krankheitsgruppen signifikant erhöht ist ( Abb. 4a, b). Darüber hinaus lässt die deutliche Hochregulierung von CD16 sowohl in Lungen-CD4+- als auch in CD8+-T-Zellpopulationen und die Anreicherung von zytotoxischen Lungen-CD4+-T-Zellen (Abb. 4c und ergänzende Abb. 4a) darauf schließen, dass T-Zellen im Lungengewebe eine antikörperabhängige Zytotoxizität erlangen. im Einklang mit veröffentlichten Berichten47.

Beim Vergleich des T-Zell-Phänotyps der Lunge mit dem der gepaarten dLNs deuten unsere Daten auf eine Verschiebung hin zur Erschöpfung innerhalb der Entzündungsstelle hin, im Gegensatz zu einem konventionelleren aktivierten Status in den sekundären lymphatischen Organen (Abb. 4c, d und Ergänzung). Abb. 4a–c). In Übereinstimmung mit dem anhaltenden T-Zell-Aktivierungsprofil berichten wir auch über einen Anstieg der CD141+HLA-DR-DQ+/- DCs in den LNs mit Fortschreiten der Erkrankung, wohingegen diese Zellen in der Lunge nicht nachweisbar sind (Abb. 4e, f und ergänzende Abb . 2a, c). CD141+ DCs stellen eine einzigartige myeloische DC-Untergruppe dar, die virales Ag nach Aufnahme von mit nekrotischen Viren infizierten Zellen kreuzpräsentiert48. Das Fehlen von Beweisen für eine virale Persistenz sowohl in der Lunge als auch in dLNs aus der verlängerten Gruppe lässt darauf schließen, dass eine anhaltende Kreuzpräsentation nekrotischer zellulärer Antigene in sekundären lymphatischen Organen die anhaltende T-Zell-Aktivierung verursacht. Andererseits ist die Erschöpfung des Lungen-T-Zellpools durch eine breite und robuste Hochregulierung von PD1 sowohl im CD4+- als auch im CD8+-T-Zellkompartiment gekennzeichnet, zusammen mit einem Anstieg von CD57 (Abb. 4a, c, d und ergänzende Abb . 4a). Diese immunmodulatorischen Moleküle werden auch in proliferierenden Zellen exprimiert, wie die Ki67-Positivität zeigt (Abb. 4a und ergänzende Abb. 4a). Jüngste Arbeiten haben einen Zusammenhang zwischen Erschöpfung und dem langfristigen Erhalt von T-Zellen identifiziert30, wobei die TGF-β-Signalübertragung eine wichtige Rolle bei der Förderung der Bildung von TPEX, einer Vorläuferpopulation erschöpfter T-Zellen, spielt. Diese Zellen zeichnen sich durch eine eingeschränkte Effektorfunktion und ein Stoffwechselprofil aus, das ihre Persistenz unterstützt49. Wir berichten tatsächlich über einen Anstieg von TGF-β in der Lunge von COVID-19-Gruppen mit chronischer und langanhaltender Erkrankung (ergänzende Abbildung 3f), und frühere Studien haben die wesentliche Rolle von TGF-β bei der Auswirkung auf fehlregulierte Immunfunktionen bei COVID-1935,50 hervorgehoben . Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass CCR7 eine stammartige TPEX-Population markiert, die in einer CCL21-reichen Stromaumgebung lokalisiert ist29. Die Tatsache, dass CCL21 in Regionen mit langfristiger T-Zell-Akkumulation in der Lunge stark angereichert ist, stützt die Annahme, dass diese Bereiche TPEX-Nischen darstellen. Somit erweitern unsere Ergebnisse das Konzept der TPEX-Nischen auf chronisch entzündetes menschliches Gewebe und ordnen die Nischen Adventitialräumen zu.

In längeren Fällen zeigten einige der mit den CCR7-Liganden CCL19 und CCL21 angereicherten Bereiche das Vorhandensein von LTB-Transkripten (Abb. 5b). Es wurde gezeigt, dass Lymphotoxin Beta (LT-β) die CCL21-Expression bei Atemwegsbelastung weiter steigert, was eine positive Rückkopplungsschleife zur Aufrechterhaltung der CCR7+ T-Zellen28 in diesen Bereichen darstellen könnte. Die Expression des B-Zell-anziehenden Chemokins CXCL1351 ist in denselben Lungenbereichen verstärkt (Abb. 5b) und lokalisiert sich gemeinsam mit PAX5, zusammen mit Hinweisen auf ein mukosales B-Zell-Profil, eine lokale B-Zell-Aktivierung und eine Antigenpräsentation. Zusammengenommen deuten die hier präsentierten Daten auf die Bildung ektopischer lymphoider Strukturen in verlängerten COVID-19-Lungen hin und verknüpfen diese Strukturen räumlich mit aktivierten Adventitia-Nischen, die TPEX enthalten und Anzeichen einer Lungenpathologie zeigen. Ob es auch einen funktionellen Zusammenhang zwischen der T-Zell-Erschöpfung und der Bildung ektopischer lymphoider Strukturen gibt, wird Gegenstand künftiger Untersuchungen sein.

Trotz der nicht zu vernachlässigenden Einschränkungen von Post-Mortem-Studien deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass eine Lungenimmunpathologie bei länger andauernder COVID-19-Erkrankung innerhalb aktivierter Adventitia-Nischen auftreten kann, unabhängig von einer aktiven Virusinfektion. Die hier identifizierten Mechanismen gelten wahrscheinlich nicht nur für COVID-19 und könnten zumindest teilweise auch auf andere chronische Krankheiten, beispielsweise Autoimmunerkrankungen, zutreffen. Wir sind uns bewusst, dass aus diesen Daten weitere mechanistische Schlussfolgerungen abgeleitet werden können, die sowohl zusätzliche als auch alternative Hypothesen darstellen. Unsere Arbeit verknüpft jedoch räumlich Gewebefibrose, T-Zell-Erschöpfung und die Organisation ektopischer lymphoider Strukturen, die allesamt Kennzeichen chronisch entzündlicher Erkrankungen und Krebs darstellen. Für uns ist es attraktiv, das Ausmaß gemeinsamer Merkmale dieser verschiedenen Erkrankungen auf räumlicher Ebene weiter zu untersuchen, um zu beurteilen, ob diese Mechanismen möglicherweise neue Wege für Therapiestrategien über COVID-19 hinaus eröffnen.

Die in dieser Studie enthaltenen Lungen- und lungenableitenden Lymphknotenproben (dLN) wurden in der Abteilung für Pathologie der Charité – Universitätsmedizin Berlin im Rahmen der COVID-19-Autopsie-Biobank gesammelt (siehe auch Ergänzungstabelle 1). Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki und mit der Genehmigung der Ethikkommission der Charité (EA 1/144/927 13, EA2/066/20 und EA1/317/20) und der Charité – BIH COVID-19 durchgeführt. 19 Forschungsausschuss. Obduktionen wurden auf der Rechtsgrundlage des §1 926 SRegG BE des Berliner Obduktionsgesetzes und des §25 Abs. 4 Infektionsschutzgesetz durchgeführt. Die Zustimmung zur Autopsie wurde von den Familien der Patienten eingeholt. Die Spenderidentitäten wurden im Krankenhaus kodiert, bevor sie zur Probenverarbeitung oder Datenanalyse weitergegeben wurden. Einige der Spender gehören zu den zuvor veröffentlichten Kohorten 9, 19, 52 und 53. Alle COVID-19-Spender zeigten zum Zeitpunkt der Krankenhauseinweisung ein positives Ergebnis in der Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) in oropharyngealen Abstrichen. Alle relevanten Merkmale und klinischen Informationen der Spender sind in Tabelle 1 dargestellt.

Zur Beurteilung der SARS-CoV-2-RNA der Lunge und dLN-Proben wurden unfixierte und, soweit möglich, nicht kryokonservierte (also native) Gewebeproben verwendet. Die RNA wurde aus etwa 50 mg homogenisiertem Gewebe, das aus allen Proben gewonnen wurde, unter Verwendung des MagNAPure 96-Systems und des MagNAPure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit (Roche) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die Kontrollen ohne COVID-19 wurden durch den Rhonda PCR-COVID-19-Schnelltest (Spindiag) gemäß dem Protokoll des Herstellers an etwa 50 mg homogenisiertem Gewebe zusammen mit einer Positivkontrolle validiert.

Eine quantitative Echtzeit-PCR für SARS-CoV-2 wurde an RNA-Extrakten durchgeführt, wobei RT-qPCR auf das SARS-CoV-2-E-Gen abzielte. Die Quantifizierung der viralen RNA erfolgte mithilfe photometrisch quantifizierter In-vitro-RNA-Transkripte54. Die Gesamt-DNA wurde in allen Extrakten mit dem Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) gemessen. Die RT-qPCR-Analyse wurde für jede Probe mindestens einmal wiederholt.

Als Korrelat der aktiven Virusreplikation in den getesteten Geweben wurde subgenomische RNA (sgRNA) mithilfe von Oligonukleotiden bewertet, die auf die transkriptionelle Leitsequenz und eine Region innerhalb der sgRNA abzielen, die für das SARS-CoV-2 E-Gen kodiert55. Alle Informationen sind in Tabelle 1 dargestellt.

Lungen-FFPE-Gewebeblöcke wurden am Tag der Autopsie entnommen und 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixiert. Die routinemäßige histologische Färbung (HE, EvG und Berliner Blau) wurde gemäß Standardverfahren durchgeführt.

Immunhistochemische Untersuchungen zur Nukleokapsidfärbung wurden im Verhältnis 1:4000 mit #HS-452 011 (Maus; Synaptic Systems) auf einem Benchmark XT-Autostainer (Ventana Medical Systems) mit standardmäßigen Antigen-Retrieval-Methoden (CC1-Puffer, pH 8,0, Ventana Medical Systems) unter Verwendung von 4- µm dicke FFPE-Gewebeschnitte. Immunhistochemische Abschnitte wurden von mindestens zwei staatlich geprüften (Neuro-)Pathologen mit Zustimmung bewertet. Zur biologischen Validierung der immunhistologischen Färbungen wurden Kontrollgewebe verwendet, die das erwartete Antigen enthielten oder ihm fehlten. Die Färbemuster wurden mit den erwarteten Ergebnissen verglichen, wie in der ergänzenden Abbildung 2B angegeben, und es wurde eine semiquantitative Bewertung angewendet (0 = keine positive Zelle, + = einzelne positive Zellen, ++ = einige positive Zellen, +++ reichlich positive Zellen und). Trümmer) (siehe Tabelle 1 und ergänzende Abbildung 2B).

Fe3+-positive Zellen wurden mittels Preußisch-Blau-Färbung von zwei unabhängigen Pathologen halbquantitativ bewertet (0 = keine positive Zelle; + = einzelne Zellen; ++ = einige Zellen und Eisenablagerungen; +++ = reichlich positive Zellen und Eisenablagerungen).

Die Bilder wurden mit einem Zeiss Axiolab 5-Mikroskop analysiert.

Gefrorene Autopsie-Lungenproben wurden aufgetaut, mit 2,5 % Glutaraldehyd und 2 % Formaldehyd in 0,1 M Natriumkacodylatpuffer fixiert und gemäß einem Routineprotokoll, einschließlich En-bloc-Färbung mit Uranylacetat und Gerbsäure, in Epon eingebettet52. Die groß angelegte Digitalisierung ultradünner (70 nm) Schnitte wurde mit einem Zeiss Gemini 300-Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop in Verbindung mit einem STEM-Detektor über die Atlas 5-Software bei einer Pixelgröße von 3–4 nm durchgeführt, wie zuvor beschrieben56. Interessante Bereiche aus den groß angelegten Datensätzen wurden durch Annotation gespeichert („kartiert“) und dann mit sehr hoher Auflösung und einer Pixelgröße von 0,5–1 nm aufgezeichnet. Andere Bilder von Viruspartikeln im Autopsie-Lungengewebe desselben Patienten wurden bereits veröffentlicht57,58,59. Wir haben versucht, die Probenhandhabung für eine optimale Gewebekonservierung zu optimieren, allerdings können durch Autolyse und suboptimale Fixierungsbedingungen verursachte Effekte nicht ausgeschlossen werden. Wir analysierten auch zwei umfangreiche Datensätze zur Autopsie der Lunge, die wir zuvor veröffentlicht hatten52 (siehe auch http://www.nanotomy.org/OA/Krasemann2022eBioMedicine/index.html).

Kryoschnitte von Lungengewebe wurden mit einem MH560-Mikrotom bei 7 µm geschnitten, auf Superfrost Plus Gold-Objektträger (Fisher Scientific, Jena, Deutschland) übertragen und an der Luft getrocknet. Die Schnitte wurden mit einem PAP-Stift (Zymed Laboratories, Jena, Deutschland) umgeben und 10 Minuten lang mit PBS rehydriert. Danach wurden die Schnitte 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 10 % Ziegenserum in PBS blockiert. Für die Immunfluoreszenzfärbung wurden die Antikörper in Färbepuffer (PBS, 5 % BSA und 0,01 % Triton) verdünnt und 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Färbung wurden folgende Antikörper verwendet: Anti-Collagen I-PE, Anti-Collagen IV-FITC, Anti-CD45-Alexa Fluor 647 und DAPI. Nach dem Färben wurden die Proben dreimal 5 Minuten lang mit PBS gewaschen und mit ProLong-Gold-Eindeckmedium (Life Technologies, Waltham, MA) eingedeckt. Die Bilder wurden durch konfokale Mikroskopie unter Verwendung eines Zeiss LSM 880-Mikroskops mit einem Objektiv mit × 20/0,5 NA (Luft) bei Raumtemperatur aufgenommen.

Frisch gefrorenes Lungen- und dLN-Gewebe wurde mit einem MH560-Kryotom (ThermoFisher, Waltham, Massachusetts, USA) auf Deckobjektträgern (24 × 60 mm; Menzel-Gläser, Braunschweig, Deutschland), die mit 3-Aminopropyltriethoxysilan beschichtet waren, in 5 µm-Schnitte geschnitten (AFFEN). Die Proben wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) mit frisch geöffnetem 2 % Paraformaldehyd in Elektronenmikroskopqualität (methanol- und RNAse-frei; Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA) fixiert. Nach dem Waschen wurden die Proben mit 0,2 % Triton Anschließend wurde eine Flüssigkeitskammer mit 100 μl PBS unter Verwendung von „press-to-seal“-Silikonfolien (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien, USA; 1,0 mm Dicke) mit einem kreisförmigen Ausschnitt (10 mm Durchmesser) erstellt auf dem Deckglas befestigt, das die Probe umgibt. Vor jedem MELC-Experiment wurde eine frische Waschlösung bestehend aus PBS mit 5 % MACS BSA (Miltenyi Biotec) und 0,02 % Triton X-100 hergestellt. Die Probe wurde auf den Probenhalter gelegt und mit Klebeband fixiert, gefolgt von einer genauen Positionierung der Binning-Linse, des Lichtwegs sowie der Köhler-Beleuchtung des Mikroskops.

Die MELC-Bildaufnahme wurde wie zuvor gezeigt durchgeführt16,17. Kurz gesagt, wir haben die gemultiplexten Histologiedaten auf einem modifizierten Toponome Image Cycler® MM3.2 (TIC) generiert, der ursprünglich von MelTec GmbH & Co.KG Magdeburg, Deutschland, hergestellt wurde15. Der ImageCycler ist ein robotisches Mikroskopsystem mit drei Hauptkomponenten: (1) einem invertierten Weitfeld-(Epi-)Fluoreszenzmikroskop Leica DM IRE2 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland), ausgestattet mit einer Hamamatsu CMOS-Kamera ORCA Flash 4.0 LT (Hamamatsu Photonics KK). , Hamamatsu City, Japan) und einem motorgesteuerten XY-Tisch, (2) ein Pipettiersystem bestehend aus einem XYZW-Roboter (Cybertron GmbH, Berlin, Deutschland) und einer CAVRO XL3000 Pipette/Diluter (Tecan GmbH, Crailsheim, Deutschland) und (3) eine TIC-Control-Software (MelTec) v3.0 zur Steuerung von Mikroskop und Pipettiersystem und zur synchronisierten Bildaufnahme.

Jedes MELC-Experiment ist eine Abfolge iterativer Zyklen, die jeweils aus vier Schritten bestehen: (i) Pipettieren des fluoreszenzgekoppelten Antikörpers auf die Probe, Inkubation und anschließendes Waschen; (ii) Kreuzkorrelations-Autofokussierung basierend auf Phasenkontrastbildern, gefolgt von der Erfassung des 3D-Stapels der Fluoreszenzbilder (+/- 5 Z-Schritte); (iii) Photobleichung des Fluorophors; und (iv) ein zweiter Autofokussierungsschritt, gefolgt von der Erfassung eines 3D-Stapels mit Fluoreszenzbildern nach dem Bleichen (+/– 5 Z-Schritte). In jedem vierstufigen Zyklus wurden bis zu vier fluoreszenzmarkierte Antikörper verwendet, die PE, FITC, APC und DAPI kombinierten, und Bilder wurden für zwei Sichtfelder (FOV) aufgenommen, um die analysierte Fläche und Zellzahl für jedes Experiment und jede Probe zu maximieren .

Die verwendeten Antikörper sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Die Antikörper wurden in der angegebenen Reihenfolge gefärbt.

Die Bildvorverarbeitung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt17. Kurz gesagt, das zu Beginn der Messung aufgenommene Referenz-Phasenkontrastbild wurde verwendet, um alle Bilder durch Kreuzkorrelation auszurichten. Anschließend wurde das Signal des Bleichbildes in jedem Zyklus und in jeder Fokusebene verwendet, um den Hintergrund zu subtrahieren und die Beleuchtung des Fluoreszenzbildes zu korrigieren, das im selben Zyklus und in derselben Fokusebene erhalten wurde15. Dadurch wurden die Autofluoreszenz des Gewebes und mögliche Restsignale vom vorherigen Bild entfernt Zyklus wurden entfernt. Bei entkoppelten Antikörpern und um das unspezifische Signal des verwendeten sekundären Antikörpers zu berücksichtigen, haben wir anstelle des Bleichbildes das Fluoreszenzbild des gefärbten und vor dem entsprechenden primären Antikörper aufgenommenen sekundären Antikörpers subtrahiert. Anschließend wurde in jedem Zyklus ein „Extended Depth of Field“-Algorithmus auf den 3D-Fluoreszenzstapel angewendet60. Die Bilder wurden dann in Fidschi normalisiert, wo ein Rolling-Ball-Algorithmus zur Hintergrundschätzung verwendet wurde, Kanten entfernt wurden (unter Berücksichtigung der maximal zulässigen Verschiebung während des Autofokusverfahrens) und Fluoreszenzintensitäten auf den gesamten Intensitätsbereich skaliert wurden (16 Bit = > 216). . Die erzeugten 2D-Fluoreszenzbilder wurden anschließend segmentiert und analysiert.

Die Segmentierung wurde in einem zweistufigen Prozess wie zuvor beschrieben17 durchgeführt, einem Signalklassifizierungsschritt mit Ilastik 1.3.261 und einem Objekterkennungsschritt mit CellProfiler 3.1.862. Ilastik wurde verwendet, um Pixel in drei Klassen zu klassifizieren: Kerne, Membran und extrazelluläre Matrix (ECM). Für jede Klasse wurde eine Wahrscheinlichkeitskarte erstellt. Die Klassifizierung von Bildern in Bezug auf Membranen und ECM erfolgte durch Summieren einer Kombination von Bildern unter Verwendung von in den jeweiligen Kompartimenten ausgedrückten Markern, während zur Klassifizierung von Kernen nur das DAPI-Signal verwendet wurde. Der Random-Forest-Algorithmus (maschinelles Lernen, Ilastik) wurde durch manuelle Pixelklassifizierung in einem kleinen Bereich eines Datensatzes (ca. 6 % des Bildes) trainiert und ohne erneutes Training auf den Rest angewendet. Anschließend wurde CellProfiler verwendet, um die Kern- und Membranwahrscheinlichkeitskarten zu segmentieren und jeweils Kerne und zelluläre Binärmasken zu generieren. Diese Masken wurden den einzelnen Fluoreszenzbildern überlagert, die für jeden Marker aufgenommen wurden, um Einzelzellinformationen (mittlere Fluoreszenzintensität, MFI) jedes Markers pro segmentierter Zelle und deren räumliche Koordinaten zu extrahieren.

Die Daten wurden mithilfe der hyperbolischen Arkussinusfunktion mit einem Skalenargument von 0,2 transformiert.

Nach dem Ausschluss von Zellen, die keinen der im MELC-Panel enthaltenen Marker exprimierten, durch Festlegen eines Grenzwerts bei MFI = 0,15 wurde die Proteinexpression von 39,074 Einzelzellen aus 14 Lungenproben und 32,258 Einzelzellen aus 7 gepaarten Lungen-dLN-Proben analysiert. Das Seurat-Paket 4.0.0 wurde in R (R Core Team (2021, 2021) (https://www.R-project.org/)63 verwendet, um eine mittlere Zentrierung und Skalierung durchzuführen, gefolgt von einer Hauptkomponentenanalyse (PCA) und reduzierte die Dimensionen der Daten auf die wichtigsten 11 Hauptkomponenten in der Lunge und 10 Hauptkomponenten in den Lungen-dLNs. Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) wurde in diesem PCA-Raum initialisiert, um die Daten zu reduzierten UMAP-Dimensionen zu visualisieren. Die Zellen waren geclustert auf PCA-Raum unter Verwendung des Shared Nearest Neighbor (SNN)-Algorithmus, implementiert als FindNeighbors und FindClusters mit n.epochs = 500 und Standardparametern (res = 0,8) für den Lungendatensatz. Wir haben 26 Cluster erhalten, die wir zusammengeführt haben, um relevante Populationen zu erhalten Unsere Analyse basierte auf kanonischen Abstammungsmarkern. Am Ende hatten wir 8 Zellcluster, die anhand zelltypspezifischer Marker, die sich als unterschiedlich exprimiert erwiesen, manuell annotiert wurden. Die Proteinexpression der Hauptzellcluster wurde mit den Funktionen UMMAPPlot, DotPlot und VlnPlot von visualisiert Seurat. 7 Zellcluster im Lungen-dLN-Datensatz wurden mit denselben Algorithmen und Funktionen, jedoch mit res = 0,2, ermittelt und visualisiert.

Wir verglichen den Phänotyp der CD4+- und CD8+-T-Zellcluster in der perivaskulären Nische mit denen in der Epithelnische. Wir definierten die Nische als den Bereich mit einem Radius von 32 Pixeln (entspricht 10 µm; die durchschnittliche Größe einer hämatopoetischen Zelle) um jede Endothel- oder Epithelzelle, ähnlich wie bei der vorherigen Analyse17. Wir haben den MFI jedes T-Zell-bezogenen Markers für die Summe aller perivaskulären Nischen und Epithelnischen extrahiert und das Expressionsprofil als Heatmap mit den Z-Score-Werten angezeigt.

Die Visualisierung der Genexpression im Lungengewebe wurde mit dem 10× Visium Spatial Genexpression Kit (10× Genomics) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die vier Erfassungsbereiche in einem 10x Genomics Visium Gene Expression-Objektträger bestehen aus 5000 Spots mit DNA-Oligos für die mRNA-Erfassung, die über einen eindeutigen räumlichen Barcode und einen Unique Molecular Identifier (UMI) verfügen. Jeder Spot hat einen Durchmesser von 55 µm und kann daher mRNA von 1 bis 10 Zellen einfangen. Gewebeschnitte aus denselben frisch gefrorenen menschlichen Lungenproben, die für MELC und snRNA-seq verwendet wurden, wurden mittels ST analysiert. Kurz gesagt, Kontroll- (n = 3) und COVID-19-Lungenproben (n = 9) von Spendern, kategorisiert nach Krankheitsdauer (akut n = 3, chronisch n = 3, verlängert n = 3), wurden mit a in 10 μm-Schnitte geschnitten MH560-Kryotom (ThermoFisher, Waltham, Massachusetts, USA) und auf 10X Visium-Objektträgern montiert, die auf –20 ° C vorgekühlt waren. Die Schnitte wurden 30 Minuten lang in vorgekühltem Methanol fixiert, 30 Minuten lang mit CD45-AF647, CD31-AF594 und DAPI angefärbt und unter Verwendung eines konfokalen LSM 880-Mikroskops (Zeiss) abgebildet. Die Schnitte wurden dann 10 Minuten lang permeabilisiert und mit dem 10x Genomics Visium Spatial Gene Expression 3' Library Construction V1 Kit wurden räumlich markierte cDNA-Bibliotheken erstellt. cDNA-Bibliotheken wurden auf einem Illumina NextSeq 500/550 unter Verwendung von 150-Zyklen-Hochleistungskits mit einer Sequenzierungstiefe von ~5000 Lesevorgängen pro Spot sequenziert. Rahmen um den Erfassungsbereich auf dem Visium-Objektträger wurden manuell ausgerichtet und das Gewebe bedeckende Punkte wurden manuell basierend auf der Immunfluoreszenzfärbung mithilfe der Software Loupe Browser 5.1.0 (10× Genomics) ausgewählt. Die Sequenzierungsdaten wurden mithilfe der Space Ranger-Software (Version 1.3.0, 10× Genomics) dem GRCH38-2020-A-Referenztranskriptom zugeordnet, um eine Feature-Spot-Barcode-Expressionsmatrix abzuleiten.

Space Ranger-Ausgaben (Merkmals-Barcode-Matrizen und Bilddaten) von 31.801 barcodierten räumlichen Punkten aus zwölf 10x Visium-Erfassungsgebieten wurden gefiltert und in R (Version 4.1.0) mit Seurat (Version 4.0.4) integriert. Aus jeder Bibliothek wurden Spots mit mindestens 250 erkannten Genen und weniger als 13 % Mitochondriengehalt kombiniert. Zu diesem Zweck wurde eine SCTransform-Normalisierung durchgeführt64, um die Pearson-Residuen aus jedem RNAseq-Datensatz zu harmonisieren. Wir haben nfeatures = 3000 für die Downstream-Integration ausgewählt. Anschließend wurde eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) an der aus Spots und Genexpressionszählungen (UMI) bestehenden Matrix durchgeführt. Die Dimensionen der Daten wurden dabei auf die 50 wichtigsten Hauptkomponenten reduziert. In diesem PCA-Raum wurde die Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) initialisiert, um die Daten zu reduzierten UMAP-Dimensionen zu visualisieren.

Die Spots wurden im PCA-Raum unter Verwendung des SNN-Algorithmus (Shared Nearest Neighbor) geclustert, der als FindNeighbors und FindClusters mit den Parametern k = 30 und res = 0,3 implementiert ist. Die Methode lieferte 12 Spot-Cluster, von denen einer hauptsächlich mit mitochondrialen Genen angereichert war. Wir haben diesen Cluster aus dem Datensatz entfernt und erneut eine PCA mit den 50 wichtigsten Hauptkomponenten FindNeighbors und FindClusters mit den Parametern k = 30 und res = 0,3 durchgeführt. Die Methode lieferte 9 Spot-Cluster, die mikroanatomische Bereiche der Lunge mit unterschiedlichen Transkriptionssignaturen darstellten und dann im UMAP-Raum visualisiert wurden.

Die integrierten Daten wurden auch verwendet, um eine Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) mit dem fgsea-Paket (Version 1.18.0)65 durchzuführen, bei der die nach Wilcoxon eingestuften Gene aus jedem Datensatz mit den Hallmark-, Reactome- und Gene Ontology-Gensätzen von MSigDB verglichen wurden (v7.4). Zur Messung des Normalized Enrichment Score (NES) wurden nur signifikant angereicherte Gene (angepasster p < 0,05) berücksichtigt. Anschließend führten wir eine Single Sample Gene Set Enrichment Analysis (ssGSEA) mit dem Escape-Paket (Version 1.2.0)66 durch, wobei die normalisierten Anreicherungswerte im räumlichen Merkmalsdiagramm in Seurat visualisiert werden können. Der NES-Bereich wurde auf die ersten und letzten fünf Perzentile beschränkt, um die Sichtbarkeit zu verbessern.

Jede Lungengewebeprobe wurde zerkleinert und 1 Stunde lang bei 37 °C in Verdauungsmedium (500 U/ml Kollagenase, 1,5 U/ml Dispase und 1 U/ml DNAse) gegeben. Die Zellen wurden durch ein 70-μm-Sieb filtriert und die enzymatische Reaktion durch kaltes RPMI mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % L-Glutamin gestoppt. Die Zellen wurden mit 50 ml kaltem RPMI mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % L-Glutamin gewaschen und die roten Blutkörperchen wurden unter Verwendung einer Lyselösung für rote Blutkörperchen (MiltenyiBiotec) lysiert. Schließlich wurden die Zellen unter Verwendung eines 40 μm FlowmiR-Zellsiebs (Millipore) filtriert und in PBS, ergänzt mit 2 % fötalem Rinderserum, in einer Konzentration von 10.000 Zellen/μl für scRNA-Seq. resuspendiert. Die Einzelzellerfassung und die nachgeschalteten Bibliothekskonstruktionen wurden mit dem Chromium Single Cell 3ʹ V3.1-Bibliotheksvorbereitungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers (10x Genomics) durchgeführt. Vollständige cDNA sowie Zell-Barcode-Identifikatoren wurden PCR-amplifiziert und Sequenzierungsbibliotheken erstellt. Die erstellten Bibliotheken wurden entweder auf dem Nextseq 500 mit 28 Zyklen für Lesevorgänge, 1,55 Zyklen für Lesevorgänge 2 und 8 Indexzyklen oder auf dem Novaseq 6000 S1 mit 28 Zyklen für Lesevorgänge 1, 64 Zyklen für Lesevorgänge 2 und 8 Indexzyklen sequenziert. bis zu einer mittleren Tiefe von 36.000 Lesevorgängen pro Zelle.

Die Cell Ranger Software Suite (Version 3.1.0) wurde verwendet, um Rohsequenzierungsdaten mit der GRCh38-Referenz zu verarbeiten. Die Analyse der Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten wurde in R (Version 3.6.1) mit Seurat (Version 3.1.1) durchgeführt. Aus jeder Bibliothek wurden Zellen mit mindestens 500 und weniger als 5000 nachgewiesenen Genen und weniger als 10 % Mitochondriengehalt kombiniert. Die Bibliothekstiefe (Gesamtzahl der UMIs) wurde zurückgeführt, als Skalierungsdaten und Bibliotheken verschiedener Spender mithilfe von IntegrateData integriert wurden. Die Clusterannotation wurde unter Verwendung des Referenzdatensatzes „Human Lung Cell Atlas“67 und des an anderer Stelle veröffentlichten TransferData-Workflows von Seurat23 durchgeführt.

Ungefähr 3 mm große kubische PFA-fixierte menschliche Lungenproben wurden zur Gewebepermeabilisierung und Entfärbung auf der Grundlage eines kürzlich veröffentlichten Ansatzes verarbeitet68. Alle Schritte wurden unter permanentem Schütteln auf einem Röhrchenrotator (MACSmixTM, Miltenyi Biotec) durchgeführt. Wir inkubierten die Proben zunächst in 5 ml 25 % w/v Quadrol-Lösung (N,N,N′,N′-Tetrakis-(2-hydroxypropyl)-ethylendiamin, Sigma-Aldrich) für 2 Tage bei 37 °C, gefolgt von 5 ml 25 % w/v Quadrol und 10 % w/v CHAPS-Lösung ((3-[3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-1propansulfonat, Sigma-Aldrich) für 5 Tage bei 37 °C68. Nach der anfänglichen Entfärbung und Permeabilisierung folgten wir dem SHIELD-Protokoll für PFA-fixierte menschliche Proben69. Daher wurden die Proben 3 Tage lang in SHIELD-OFF-Lösung bei 4 °C inkubiert und dann 24 Stunden lang bei RT in SHIELD-ON-Puffer und SHIELD-Epoxidlösung im Verhältnis 1:1 gegeben. Anschließend ist die SHIELD-Konservierung abgeschlossen und wir haben die Proben einen Tag lang in PBS mit drei Pufferwechseln bei 4 °C gewaschen. Als nächstes haben wir die Proben 3 Tage lang aktiv mit stochastischem Elektrotransport (SmartClear Pro, LifeCanvas Technologies) gereinigt und den gleichen Waschschritt wie zuvor durchgeführt.

Zur Immunfärbung wurden Lungenproben 1 Tag lang in Blockierungspuffer (0,2 % Triton DMSO/0,2 % Tween-20/PBS) bei 37 °C für 7 Tage mit den jeweiligen Antikörpern (wie für die jeweiligen Proben angegeben). Für die Färbung verwendeten wir folgende Antikörper und Verdünnungen: Sytox-AF488 (1:40.000, Thermo Fisher), ER-TR7-AF546 (1. 1:200/2. 1:100, Santa Cruz Biotechnology) oder Nahinfrarot (NIR) CD3- iFluor790 (1:50, AAT Bioquest, Inc., Sunnyvale, CA, USA). Nach der Färbung wurden die Proben zunächst mit Waschpuffer (0,2 % Tween-20/PBS) 1 Tag lang bei 37 °C und mit PBS bei 4 °C mit jeweils drei Pufferwechseln gewaschen. Anschließend wurden immunmarkierte Proben zur Indexübereinstimmung zunächst einen Tag lang in 50 % EasyIndex (LifeCanvas Technologies, Brechungsindex –RI- 1.456) in ddH2O und anschließend in 100 % Easy Index inkubiert, bis innerhalb von 1–2 Tagen Transparenz erreicht wurde.

Wir haben die menschlichen Lungenproben leicht auf eine Kunststoffplatte geklebt und die Probe in eine 5 × 5 × 45 mm große Quarzküvette (msscientific Chromatographie-Handel GmbH) in 100 % Easy Index-Lösung getaucht. Zur Bildaufnahme tauchten wir die kleinere Küvette mit der Lungenprobe in die größere Quarzküvette (LaVision Biotec), gefüllt mit einer passenden Quarzglasflüssigkeit mit einem RI von 1.459 (Cargille Laboratories). Zur Aufnahme von Lichtblattbildern verwendeten wir ein Ultramikroskop II (LaVision BioTec), gekoppelt an ein Olympus MVX10-Zoomgehäuse mit einem Zoomverhältnis von 0,63×–6,3× und einem 2×-Tauchobjektiv (Olympus MVPLAPO2XC/0,5 NA [WD = 5,6 mm, korrigiert]), was zu einer Gesamtvergrößerung im Bereich von 1,36 führt ×–13,56×. Das Ultramikroskop II mit einer lateralen Auflösung von ~4 µm war mit einer Andor Neo sCMOS-Kamera mit einer Pixelgröße von 6,5× 6,5 µm² und einem LaVision BioTec Lasermodul mit den folgenden Filtersätzen ausgestattet: ex 488 nm, em 520/50 nm; ex 561 nm, em 620/60 nm; ex 785 nm, em 835/70 nm. Wir verwendeten den 488-nm-Ex für die Erzeugung von Autofluoreszenzsignalen und den Nachweis des nuklearen Sytox-AF488-Signals, den 561-nm-Ex für den Nachweis des ER-TR7-AF546-Signals und den NIR-785-nm-Ex für den Nachweis von CD3-iF790. Wir haben zuerst die längste Wellenlänge abgebildet, um Photobleichung während der Bildgebung zu vermeiden, und eine lineare Z-Anpassung des Ex durchgeführt. 785-nm-Laser. Für alle Aufnahmen haben wir einen optischen Gesamtzoom von 8,61× und einen Z-Schritt von 5 µm verwendet. Größere Kachelscans wurden mit 10 % Überlappung entlang der Längs-X-Achse und der Y-Achse der menschlichen Lungenprobe erfasst und die Laserleistung wurde abhängig von der Intensität des Signals angepasst (um die Sättigung nicht zu erreichen).

Wir haben für jeden Kanal separat 16-Bit-Graustufen-TIFF-Bilder durch Lichtblattmikroskopie mit der ImSpector-Software (LaVision Biotec) aufgenommen. TIFF-Stacks wurden in Imaris-Dateien (.ims) konvertiert (ImarisConverterx64) und mit Imaris Stitcher zusammengefügt. Wir verwendeten Imaris (Bitplane) für die 3D- und 2D-Bildvisualisierung, die Erstellung von Schnappschüssen und die Erstellung von Filmen. Wir führten eine Hintergrundsubtraktion entsprechend dem Durchmesser der jeweiligen Strukturen durch, um unspezifische Hintergrundsignale zu eliminieren.

Alle für diese Studie verwendeten Instrumente, Reagenzien, Software und Algorithmen sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Im Zeitraum 03/2020 und 09/2020 wurden alle möglichen Langzeit-COVID-19-Spender mit einer Obduktion an der Charité Universitätsmedizin Berlin, bei der die COVID-19-Diagnose gestellt wurde und entsprechendes Gewebe zur Analyse zur Verfügung stand, in diese Studie einbezogen. Unter den Fällen mit verfügbarem Gewebe wurden nach dem Zufallsprinzip (nach Alter und Geschlecht) akute, chronische und Kontrollfälle ausgewählt. Alle Spender mit einem Lungentumor, einer hämatologischen Stammzelltherapie oder einer Autoimmun-Komorbidität wurden ausgeschlossen. Wir verwendeten die gleichen Ausschlusskriterien für die Kontrollen, jedoch mit negativer PCR und Immunhistochemie für SARS-CoV-2 als zusätzliche Einschlusskriterien. Es wurde keine statistische Methode verwendet, um die Stichprobengröße vorab zu bestimmen, und eine zusätzliche Randomisierung ist für unsere Studie nicht relevant, da die Stichprobenstratifizierung auf der Grundlage der Krankheitsdauer durchgeführt wurde, um Unterschiede auf der Grundlage dieses bestimmten klinischen Parameters abzufragen. Wir analysierten postmortale Gewebeproben von 17 menschlichen Spendern (4 Kontrollpersonen, 3 akute Fälle einer COVID-19-Erkrankung, 5 Fälle einer chronischen COVID-19-Erkrankung und 5 Fälle einer längeren COVID-19-Erkrankung).

Ein analysierter Kontrollfall musste aufgrund der postmortalen PCR und des immunhistochemischen Nachweises einer klinisch unauffälligen SARS-CoV-2-Infektion ausgeschlossen werden.

Mindestens zwei verschiedene Bereiche jeder Probe wurden mittels Multiplex-Mikroskopie analysiert. Die Experimente wurden in mindestens 3 Wiederholungen pro Krankheitsgruppe durchgeführt. Alle Replikationsversuche waren erfolgreich, mit Ausnahme von zwei von vierzehn mittels ST analysierten Gewebeschnitten, die sehr geringe cDNA-Mengen ergaben, dennoch für die Bibliotheksvorbereitung verwendet wurden, die anschließende Qualitätskontrolle jedoch nicht bestanden. Diese beiden Gewebeschnitte und die daraus extrahierten Daten wurden nicht für die weitere Analyse oder Manuskripterstellung verwendet. Die Auswertung der histologischen und immunhistochemischen Färbung (Gewebeanmerkungen und Fibrosebewertung) wurde separat von mindestens zwei unabhängigen Bewertern durchgeführt, die hinsichtlich der Krankheitsdauer verblindet waren. Multiplex-Histologie, Elektronenmikroskopie, Lichtblattmikroskopie, snRNAseq- und ST-Datenerfassung, -verarbeitung und -analyse waren nicht verblindet.

Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism® 9.2.0 (Graph Pad Software, LA Jolla, CA, USA) durchgeführt. Die verwendeten Tests und die genauen p-Werte werden in jeder Abbildung und in der Abbildungslegende beschrieben. Die Signifikanz wurde durch p < 0,05 definiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Nicht identifizierte räumliche Transkriptomdaten von Menschen/Patienten wurden bei Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) unter dem Eintrag GSE190732 hinterlegt und sind öffentlich verfügbar. SnRNASeq-Daten wurden auch bei GEO (https://doi.org/10.1183/13993003.02725-2021) hinterlegt und sind unter den Datensätzen GSM5958253, GSM5958254, GSM5958255, GSM5958256, GSM5958257, GSM5958258, GSM5958259 und GSM59 zugänglich 58260.Auch gemultiplexte Histologiedaten Die zur erneuten Analyse der in dieser Studie gemeldeten Daten erforderlichen Merkmalsmatrizen und räumlichen Koordinaten sind im Zenodo-Repository unter DOI: 10.5281/zenodo.7447490 und allen verknüpften/verwandten Identifikatoren öffentlich verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

In dieser Studie wurde kein Originalcode verwendet.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken den Patienten und ihren Angehörigen für die Zustimmung zur Autopsie und der anschließenden Forschung. Wir danken Ralf Uecker und Gudrun Holland für die technische Unterstützung. Diese Studie wurde durch Mittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft, HA5354/10-1, HA5354/12-1, SPP1937 (HA5354/8-2) und TRR130 P17 an AEH, TRR 130 C01 und SFB 1444 P14 (an AEH und RAN) unterstützt. . RAN wurde durch DFG 1167/5-1 gefördert. HR wurde von der DFG gefördert (RA 2491/1-1 und SFB 130 TP17). ACH wurde von der Berlin University Alliance GC2 Global Health (Corona Virus Pre-Exploration Project), dem BMBF (RAPID und Organo-Strat, alvBarriere-COVID-19) sowie der DFG (SFB-TR 84, B6/Z1a) unterstützt Berlin Institute of Health (BIH), Charité 3R und Charité-Zeiss MultiDim. SE, FH, HR und RM wurden vom BMBF (Defeat Pandemics, Organo-Strat) gefördert, FH wurde von der DFG im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie EXC-2049-390688087 sowie SFB TRR 167 und HE 3130/6-1 gefördert. BO wurde durch die BIH Clinical Single Cell Bioinformatics Pipeline finanziert. Darüber hinaus danken wir der Charité-Stiftung (Max Rubner Preis 2016) für die finanzielle Unterstützung. CDM-FM wurde durch Zuschüsse der Leibniz-Gemeinschaft (Leibniz Collaborative Excellence, TargArt und ImpACt) unterstützt, das Berlin Institute of Health (BIH) mit dem Starting Grant -Multi-Omics-Charakterisierung der SARS-CoV-2-Infektion, Projekt 6, Identifizierung immunologischer Ziele bei Covid-19, Land Berlin und Europäischer Fonds für regionale Entwicklung (EFRE 2014–2021, EFRE 1.8/11, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum) und das Bundesministerium für Bildung und Forschung (CONAN und TReAT).

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Josefine Radke

Present address: Institut für Pathologie, Universitätsmedizin Greifswald, Greifswald, Germany

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ronja Mothes, Anna Pascual-Reguant.

Diese Autorinnen haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Helena Radbruch, Anja E. Hauser.

Department of Neuropathology, Charité–Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 10117, Berlin, Germany

Ronja Mothes, Carsten Dittmayer, Regina von Manitius, Jenny Meinhardt, Josefine Radke, Frank L. Heppner, Tom Aschman & Helena Radbruch

Immune Dynamics, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum (DRFZ), a Leibniz Institute, Charitéplatz 1, 10117, Berlin, Germany

Ronja Mothes, Anna Pascual-Reguant, Ralf Koehler, Juliane Liebeskind, Alina Liebheit, Sandy Bauherr & Anja E. Hauser

Department of Rheumatology and Clinical Immunology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 10117, Berlin, Germany

Anna Pascual-Reguant, Juliane Liebeskind, Alina Liebheit & Anja E. Hauser

Institut für Molekulare und Klinische Immunologie, Medizinisches Zentrum der Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg, Magdeburg, Deutschland

Lars Philipsen

Multiparametrische Bioimaging- und Zytometrie-Plattform (MPBIC), Medizinische Fakultät, Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg, Magdeburg, Deutschland

Lars Philipsen

Zentrum für Biologische Gefahren und Besondere Krankheitserreger (ZBS), Robert Koch-Institut, Berlin, Deutschland

Michael Laue

Institute of Pathology, Charité–Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin, Germany

Sefer Elezkurtaj & Jana Ihlow

Therapeutic Gene Regulation, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum (DRFZ), a Leibniz Institute, Berlin, Germany

Pawel Durek, Frederik Heinrich, Gitta A. Heinz, Gabriela M. Guerra und Mir-Farzin Mashreghi

Core Unit Bioinformatics (CUBI), Berlin Institute of Health at Charité-Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Germany

Benedikt Obermayer

Berlin Institute of Health (BIH), Berlin, Deutschland

Josefine Radke & Leif E. Sander

Deutsches Krebskonsortium (DKTK), Partnerstandort Berlin, CCCC (Campus Mitte), Berlin, Deutschland

Josefine Radke

Exzellenzcluster, NeuroCure, Berlin, Deutschland

Frank L. Heppner

Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen (DZNE) Berlin, Berlin, Deutschland

Frank L. Heppner

Department of Nephrology and Medical Intensive Care, Charité-Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 12203, Berlin, Germany

Philipp Enghard & Helena Stockmann

Institute of Virology, Charité–Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin and German Centre for Infection Research, Berlin, Germany

Julia Schneider & Victor M. Corman

Abteilung für Infektionskrankheiten, Beatmungsmedizin und Intensivmedizin, Charité-Universitätsmedizin Berlin und Deutsches Zentrum für Lungenforschung (DZL), Berlin, Deutschland

Leif E. Sander & Andreas C. Hocke

Genomics Technology Platform, Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft (MDC), Berlin, Deutschland

Thomas Konrad

Dynamic and Functional in vivo Imaging, Veterinary Medicine, Freie Universität Berlin, Berlin, Germany

Raluca A. Niesner

Biophysical Analysis, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum (DRFZ), a Leibniz Institute, Berlin, Germany

Raluca A. Niesner

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AEH, HR, APR und RM konzipierten die Studie. JM, JR, HR und FLH organisierten die Biobank. ML, CD, SE, GAH, BO, JI, FH, PE, HS, TA, JS, VC, LES, MF.M., TC, ACH, LP, HR, RN und AEH stellten Ressourcen und Fachwissen zur Verfügung. GMG, JL, AL, RM und APR führten Experimente durch. RvM, FH, PD, RK, JL, AL, RM und APR analysierten die Daten. RM, APR, HR und AEH interpretierten die Ergebnisse und verfassten das Manuskript. HS, TA, BO, SB, RK, RM, APR, MF.M, RN, HR und AEH überprüften das Manuskript.

Korrespondenz mit Anja E. Hauser.

LP ist mit der BioDecipher GmbH verbunden, einem Unternehmen, das Systeme für die Multiplex-Fluoreszenzmikroskopie entwickelt. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Richard Enelow, Jay Rappaport und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Mothes, R., Pascual-Reguant, A., Koehler, R. et al. Bestimmte Gewebenischen steuern die Immunpathologie der Lunge über CCL18 und CCL21 bei schwerem COVID-19. Nat Commun 14, 791 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36333-2

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Eingegangen: 10. März 2022

Angenommen: 23. Januar 2023

Veröffentlicht: 11. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36333-2

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