Neue Erkenntnisse über die Einnahme von pflanzlichem Defensin lösten Stoffwechselreaktionen beim polyphagen Insektenschädling Helicoverpa armigera aus

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 3151 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der Lepidopteren-Insektenschädling Helicoverpa armigera ist einer der zerstörerischsten Schädlinge von Kulturpflanzen und es werden derzeit mehrere biotechnologische Ansätze zu seiner Bekämpfung entwickelt. Pflanzliche Defensine sind kleine kationische und Cystein-reiche Peptide, die eine Rolle bei der pflanzlichen Abwehr spielen. Die Einnahme eines Defensins aus Capsicum annuum (CanDef-20) führte bei H. armigera zu einer dosisabhängigen Verringerung der Larven- und Puppenmasse, einer verzögerten Metamorphose und auch zu einer stark verringerten Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeit. Um die molekularen Mechanismen der durch die Einnahme von CanDef-20 vermittelten Antibiose bei H. armigera-Larven zu verstehen, wurde eine vergleichende Transkriptomanalyse durchgeführt. Die vorherrschende Herunterregulierung von GOs stellt Endopeptidasen vom Serin-Typ, strukturelle Bestandteile von Ribosomen und integralen Membrankomponenten sowie eine unterschiedliche Hochregulierung der ATP-Bindung, des Kerns und der Translation dar, während eine Hochregulierung der Nukleinsäurebindung, dargestellt durch transponierbare Elemente, festgestellt wurde. Es wurde festgestellt, dass verschiedene Isoformen von Lipase, Serin-Endopeptidase, Glutathion-S-Transferase, Cadherin, alkalischer Phosphatase und Aminopeptidasen als kompensatorische Reaktion auf die Einnahme von CanDef-20 hochreguliert werden. In-vitro-Enzymtests und qPCR-Analyse einiger repräsentativer Gene, die mit lebenswichtigen zellulären Prozessen wie Metamorphose, Nahrungsverdauung und Darmmembran assoziiert sind, deuteten auf adaptive Differenzialregulationen bei mit CanDef-20 gefütterten H. armigera-Larven hin. Wir kommen zu dem Schluss, dass die Einnahme von CanDef-20 den Insektenstoffwechsel auf verschiedene Weise beeinflusst, indem es mit Zellmembranen, Enzymen und zytoplasmatischen Proteinen interagiert und die Mobilisierung von Transposonen auslöst, die mit Wachstumsverzögerungen und Anpassungsstrategien bei H. armigera verbunden sind.

Schadinsekten führen zu erheblichen Ertragseinbußen bei Kulturpflanzen, entweder durch direkte Schädigung oder durch die Ausbreitung von Krankheiten. Unter den Insektenschädlingen, die Kulturpflanzen bedrohen und befallen, ist Helicoverpa armigera polyphag und am verheerendsten1. Bekämpfungsmaßnahmen wie der Einsatz verschiedener Pestizide und Ansätze auf der Basis von Cry-transgenen Pflanzen wurden weltweit eingesetzt, obwohl H. armigera eine Resistenz entwickelt2, was zum Scheitern dieser Methoden führt und die Entwicklung neuer biologischer Ansätze für eine nachhaltige und umweltfreundliche Schädlingsbekämpfung erforderlich macht.

Polyphage Insekten haben mehrere Resistenzmechanismen wie die Produktion von Glutathion-S-Transferase, Glucoseoxidase, die Überexpression von unempfindlicher Protease und Cytochrom-P450-Monooxygenase entwickelt, um mit der pflanzlichen Abwehr fertig zu werden3. Die molekularen Mechanismen der Resistenz von Bt-Transgenen wurden in den letzten Jahren untersucht. Die Mutation im Cadherin- und ABCC2-Transporter-Gen im Bürstensaumepithel von H. armigera und H. virescens führte zu einer Resistenz gegen Bt-Toxin4. Darüber hinaus waren eine veränderte Expression von alkalischer Phosphatase (ALP)5, Aminopeptidase N (APN)6 und regulatorische Ereignisse in der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK)7 die Resistenzmechanismen, die Schmetterlingsinsekten gegen Bt-Toxin nutzten. Diese Studien liefern Hinweise auf eine bemerkenswerte Vielfalt und Plastizität im Insektenstoffwechsel, um der pflanzlichen Abwehr entgegenzuwirken.

Pflanzen haben ausgefeilte regulatorische Netzwerke entwickelt, um konstitutive und induzierte Abwehrreaktionen gegen Angriffe von Pflanzenfressern zu präsentieren3. Die Induktion von Jasmonat (JA) und Salicylsäure (SA)4, gefolgt von der Produktion von Sekundärmetaboliten, Proteinase-Inhibitoren (PIs)5 und antimikrobiellen Peptiden (AMPs), bestimmt eine schädlingsspezifische Pflanzenabwehrreaktion. Die Wirkung von AMPs auf Insekten ist nicht eindeutig geklärt, und es ist bekannt, dass die Wahrscheinlichkeit, bei Bakterien Resistenzen gegen AMPs zu entwickeln, viel geringer ist als gegen Antibiotika8. Daher wird uns die Untersuchung des Gegenabwehrmechanismus des Insekts gegen pflanzliche Abwehrmoleküle wie Defensinpeptide dabei helfen, Abwehrmoleküle für eine bessere Schädlingsbekämpfung in Pyramidenform zu bringen9.

AMPs wie Defensine wurden im Zusammenhang mit H. armigera-Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Insekten weniger erforscht, obwohl ihre Rolle als antimykotische und antibakterielle Peptide anhand ihrer Wechselwirkungen mit den Zellmembranen10, zytoplasmatischen Proteinen11 und Transmembrankanälen12 gut untersucht ist. Pflanzliche Defensine sind kationische Peptide mit ca. 45–50 Aminosäuren mit einer konservierten dreidimensionalen Struktur, die eine Cystein-stabilisierte αβ (CSαβ)-Faltung, vier bis fünf Disulfidbindungen und ein γ-Kernmotiv13 darstellt – die Hauptdeterminante, die antimykotische und antibakterielle Aktivität verleiht 14. Einige Studien bestätigen die direkte Zellmembranbindungsaktivität des γ-Kernmotivs15,16. In unserer vorherigen Arbeit haben wir das wachstumshemmende Potenzial von Capsicum annuum Defensin (CanDef-20) bei H. armigera diskutiert17. CanDef-20 verursachte eine Verzögerung der Larvenmasse um etwa 15 % und eine Verringerung der Puppenmasse um 12 %, obwohl die Mechanismen, durch die CanDef-20 physiologische und morphologische Auswirkungen auf den Insektenschädling hervorruft, unklar blieben. Die vorliegende Studie versucht, den Wirkungsmechanismus von CanDef-20 in H. armigera durch einen Transkriptomik-Ansatz zu entschlüsseln.

In dieser Studie wollten wir (i) die dosisabhängigen Auswirkungen der Einnahme von CanDef-20 bei H. armigera verstehen, (ii) die physiologischen und molekularen Reaktionen von H. armigera, der mit rekombinantem CanDef-20 gefüttert wurde, mithilfe eines vergleichenden De-novo-Transkriptomik-Ansatzes aufklären und (iii) die Korrelationen der Genexpressionsniveaus mit der Protein-/Enzymaktivität und den adaptiven Reaktionen von H. armigera auf die Aufnahme von pflanzlichem Defensin CanDef-20 zu verstehen. Das Verständnis der Rolle und des Wirkungsmechanismus pflanzlicher Defensine bei Insektenschädlingen wird ein Fortschritt bei der Entwicklung nachhaltiger Schädlingsbekämpfungsmaßnahmen für die Landwirtschaft sein.

Die Blütengewebe von C. annuum (lokale Sorte Phule Jyoti) wurden zur Amplifikation und Klonierung des CanDef-20-Gens wie zuvor beschrieben17 verwendet. Die C. annuum-Samen wurden auf dem lokalen Markt beschafft und in einem Polyhouse gezüchtet. Die molekularbiologischen Experimente wie die Amplifikation des Defensin-Gens, das Klonen von Genen und die rekombinante Expression von Proteinen wurden nach Genehmigung durch das Institutional Bio-Safety Committee (IBSC-SPPU) gemäß den Richtlinien der Abteilung für Biotechnologie des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie durchgeführt. Indische Regierung http://dbtbiosafety.nic.in/ oder Richtlinien und Handbuch.

Die H. armigera-Eier wurden vom National Bureau of Agricultural Important Resources (NBAIR), Bangalore, bezogen. Man ließ die Eier schlüpfen und die Neugeborenen wurden wie zuvor beschrieben auf eine künstliche Diät umgestellt17. Für Bioassays mit CanDef-20 wurden nur im Labor gezüchtete Insekten einer Generation verwendet.

Die Expression des rekombinanten CanDef-20-Proteins und der Dot-Blot-Assay wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt17. Für die Proteinexpression wurden der Stamm Pichia pastoris mit Genkonstrukten (CanDef-20) oder der leere Vektor (EV) im pPICZ-Alpha-Vektor in gepuffertem Methanolkomplexmedium (BMMY) (10 × Hefestickstoffbasis und gepuffert mit 1 M Kaliumphosphat) verwendet Puffer pH 6,0) (Hi-media, Indien). Die rekombinanten Proteine ​​wurden aus Kulturüberstand nach 90 %iger Ammoniumsulfatfällung und Dialyse gewonnen. Proteinproben wurden einer SDS-PAGE unter Verwendung von 15 % (Gew./Vol.) Polyacrylamidgelen18 unterzogen. Die mit diesem System exprimierten rekombinanten Proteine ​​trugen einen C-terminalen 6X His- und Myc-Tag.

Das rekombinante CanDef-20 wurde durch Dot-Blot-Assay unter Verwendung eines Kaninchen-Anti-Myc-Primärantikörpers (Abcam, USA) bestätigt, der gegen den c-Myc-Tag des rekombinant exprimierten CanDef-20 gerichtet war. Es wurde ein Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper aus dem Western Blot Development Kit (Bangalore Genie, Indien) verwendet. Schließlich wurden die Spots durch Inkubation der Membran in BCIP/NBT-Lösung entwickelt.

Der H. armigera-Larven-Bioassay wurde an Neugeborenen des zweiten Lebenstages durchgeführt, die einer künstlichen Ernährung (AD) unterzogen wurden. Das im Fütterungstest verwendete AD bestand aus Haupt- und Nebenkomponenten, die Ascorbinsäure, Sorbinsäure, Hefeextrakt, Cholesterin, Vitamine, Methylhydroxybenzoat und Kichererbsenmehl enthielten und mit in Wasser gekochtem Agar-Agar gemischt wurden, um ein halbfestes Futter zu bilden19 . Insgesamt 25 Neugeborene wurden einzeln auf AD entlassen, dem 15,5 und 31,25 μg/ml rekombinantes CanDef-20 beigemischt waren, und es wurde als Satz 1 in einem separaten kleinen Behälter mit einem Durchmesser von 3 cm betrachtet. Set-2 mit 50 Neugeborenen wurde parallel durchgeführt und besteht aus 62,25, 125, 250 μg/ml rekombinantem CanDef-20. Die von AD (Kontrolle) und EV in P. pastoris exprimierten Proteine ​​(EV-Kontrolle) wurden einzeln für die jeweiligen Sätze getestet. Larvenmasse, Entwicklung, Mortalität, Puppenmasse, Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeit wurden während des Bioassays bis zu 22 Tage lang aufgezeichnet. Alle Bioassay-Sets wurden bei 30 °C und 70 % ± 10 % Luftfeuchtigkeit mit einer Photoperiode von 16 Stunden gehalten. Die Larven- und Puppenmasse wurde regelmäßig erfasst. Die gebildeten Puppen wurden in Bechern getrennt und auf das Schlüpfen von Motten überwacht. Die Motten wurden mit 10 %iger Zuckerlösung gefüttert und konnten sich in einem Käfig (30 × 20 × 15 cm) mit abnehmbarem Netztuch im Verhältnis 8:4 und 12:6 (Verhältnis Weibchen:Männchen) für Satz 1 bzw. 2 paaren auf dem Deckel zum Eiersammeln. Die Anzahl der geschlüpften Eier und Neugeborenen wurde aufgezeichnet.

Insektenproben (gefüttert mit 125 μg/ml rekombinantem CanDef-20 und mit in die EV-Kontrolle integriertem AD) wurden zur RNA-Isolierung unter Verwendung des TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet. Bibliotheken wurden mit dem TruSeq DNA PCR-Free-Kit gemäß den Empfehlungen des Herstellers erstellt. Die Sequenzierung wurde mit Illumina HiSeq durchgeführt. 2000-System (Illumina, San Diego, CA, USA) mit Paired-End-Read-Strategie. Die BCL-Binärdatei (Base Calls) wird mithilfe des Illumina-Pakets bcl2fastq (v1.8.4) in FASTQ konvertiert.

Die Rohlesevorgänge wurden mit dem Fastqc-Tool20 überprüft und das Cutadapt-Tool21 wurde zum Entfernen von Adaptern und Sequenzen geringer Qualität verwendet. Außerdem wurde festgestellt, dass Sequenzdateien einen durchschnittlichen Phred-Score pro Basis von > 30 haben. Normalisierte Lesevorgänge wurden mit der Software Trinity v2.0.622 zu längeren Fragmenten (Contigs) zusammengesetzt. Zusammengesetzte Transkripte wurden mithilfe des Transdecoder-Tools23 nach Codierungstranskripten durchsucht. Diese zusammengestellten Transkripte wurden mithilfe eines Transdecoder-Programms weiter auf den ORF-Befund und auf die Vollständigkeit des Transkripts durchsucht. Alle Protein-kodierenden Sequenzen wurden mithilfe der Insekten-Uniprot-Proteindatenbank mit einem E-Wert-Grenzwert < 1e−10 nach weiteren Annotationen durchsucht. Einige unterschiedlich exprimierte, nicht charakterisierte Gene wurden mithilfe der Uniprot-ID- und BLAST-Analyse weiter identifiziert. Zur weiteren Bewertung der Vollständigkeit der Zusammenstellung und Annotation wurde eine BUSCO-Analyse (Benchmarking Universal Single Copy Orthologs, Version 5.4.3) durch Vergleich mit der Abstammungslinie der Arthropoden in Standardeinstellungen durchgeführt (http://busco.ezlab.org/).

Um die Genexpressionsprofile der mit CanDef-20 und EV-Kontrolle gefütterten H. armigera zu vergleichen, wurden saubere Lesevorgänge jeder Bibliothek mithilfe der RSEM-Software24 auf die Assemblierung abgebildet und eine Abundanzschätzung wurde im Trinity-Paket durchgeführt. Die Expressionsniveaus der Transkripte wurden basierend auf der FPKM-Normalisierungsmethode unter Verwendung des EdgeR-Pakets25 berechnet. Die Identifizierung differentiell exprimierter Gene (DEGs) wurde unter Verwendung von EV-Kontrollbibliotheken als Referenz durchgeführt. Die FPKM-Werte der Gene, die sowohl in der mit CanDef-20 gefütterten (behandelten) als auch in der EV-Kontrolle nachgewiesenen Gene ermittelt wurden, wurden zur Ableitung des Verhältnisses (behandelt/Kontrolle) verwendet, auf das eine Log-2-Skala angewendet wurde, um Fold-Change-Werte zu erhalten. Transkripte mit log2FC ≥ ± 2 mit P-Wert ≤ 0,05 und FDR ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikanteste DEGs herausgefiltert. Um mehr DEGs und einzigartig exprimierte Gene aus mit CanDef-20 gefütterten Larven zu erhalten, wurden auch Transkripte mit log2FC-Verhältnissen ≥ + 0,8 und ≤ – 0,8 identifiziert. Transkripte mit log2FC ≥ + 0,8 galten in mit CanDef-20 gefütterten Larven als hochreguliert, wohingegen Transkripte mit Fold-Change-Werten (≤ – 0,8) als herunterreguliert galten. Schließlich wurde eine GO-Anreicherungsanalyse für DEG-Sätze unter Verwendung der manuellen Methode und der FUNC-Software26 durchgeführt.

Für die RNA-Extraktion wurden ganze, in flüssigem Stickstoff (50 mg) pulverisierte Larven von CanDef-20 verwendet, die das 4. Larvenstadium (125 und 250 μg/ml gefütterte H. armigera-Larven), EV-Kontrolle und AD gefüttert aufnahmen. Dabei handelte es sich um andere Insektenproben als die für die Sequenzierung verwendeten, die jedoch unter ähnlichen Versuchsbedingungen behandelt wurden. cDNA wurde aus 1000 ng RNA unter Verwendung eines Verso-cDNA-Reverse-Transcription-Kits (Thermofisher, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Primer wurden mit NCBI Primer (Ergänzungstabelle S3) entworfen und vor der Echtzeitanalyse durch Analyse ihrer PCR-Amplifikationseffizienz (E) und Korrelationskoeffizienten (R2) validiert. Die Reaktionsmischung besteht aus 1 μl einer 0,5-fach verdünnten cDNA-Matrize, 5 μl 2 × Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Litauen), 1 μl jedes genspezifischen Primers und ddH2O, um das Volumen aufzufüllen . Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 50 °C für 2 Minuten, 95 °C für 2 Minuten, 40 Zyklen von 95 °C für 10 Sekunden, 60 °C für 30 Sekunden; mit Schmelzkurve 5 s bei 95 °C, 65–95 °C, 0,5 °C Anstieg/Zyklus. Die 2−ΔΔCt-Methode wurde verwendet, um die relative Faltungsänderung in der quantitativen Echtzeit-PCR zu erfassen, und das H. armigera-Aktin-Gen wurde zur Normalisierung der Daten verwendet.

Die mit AD und AD gefütterten H. armigera-Larven mit 125 μg/ml CanDef-20- bzw. EV-Proteinen wurden zum Nachweis der gesamten Enzymaktivitäten von Amylase, Protease, Lipase, Glutathion-S-Transferase (GST), Aminopeptidase und alkalischer Phosphatase verwendet Enzyme. Kurz gesagt, 50 mg ganze Larven, pulverisiert in flüssigem Stickstoff, wurden in 200 μl 0,2 M Glycin-NaOH-Puffer, pH 10,0, homogenisiert und 2 Stunden lang bei 4 °C gehalten. Die Suspension wurde 20 Minuten lang bei 4 °C und 10.000 U/min zentrifugiert und der resultierende Überstand wurde als H. armigera-Enzympräparat (HEP) verwendet. Der Gesamtproteingehalt von HEP ​​wurde nach der Bradford-Methode berechnet und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.

Die Amylaseaktivität wurde mithilfe der 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNSA)-Methode27 getestet. Die Testmischung bestand aus 125 μl 0,02 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,9, der 6 mM Natriumchlorid und 40 μg HEP enthielt, und wurde 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Diese enzymatische Reaktion wurde mit 1,0 ml DNSA-Reagens beendet, gefolgt von einer 5-minütigen Inkubation in einem kochenden Wasserbad, Abkühlen auf Raumtemperatur und 10-facher Verdünnung der Reaktionen mit Wasser und Messung der Absorption bei 540 nm. Die am Ende der Amylase-Enzymaktivität freigesetzten freien Zucker wurden mithilfe eines Standard-Maltose-Diagramms geschätzt.

Die Schätzung der gesamten Protease-Enzymaktivität wurde unter Verwendung von Azocasein als Substrat19,28 mit 40 μg HEP bestimmt. Kurz gesagt, 40 μg HEP-Enzym wurden zu 200 μl 1 % Azocasein (hergestellt in 0,2 M Glycin-NaOH, pH 10,0) gegeben und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 300 µl 5 %iger Trichloressigsäure gestoppt. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 12.000 U/min wurde dem Überstand ein gleiches Volumen 1 M NaOH zugesetzt. Die Absorption wurde bei 450 nm gemessen und eine Proteinase-Einheit wurde als die Enzymmenge berechnet, die die Absorption unter den gegebenen Testbedingungen um 1,0 OD erhöhte. Die Aktivität der Protease wurde in Einheiten/µg/min/ml Protein ausgedrückt.

Die GST-Aktivität wurde unter Verwendung von 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol (CDNB) (Sigma, Missouri, USA) als Substrat gemäß der zuvor beschriebenen Methode geschätzt29. Das Reaktionsgemisch (1000 μl) enthielt Phosphatpuffer pH = 7 (980 μl), reduziertes Gluthion (GSH) 200 mM (10 μl), CDNB 100 mM (10 μl) und HEP 40 μg. Bei Kontrollreaktionen wird anstelle des Enzyms Puffer zugesetzt. Die Absorption der Reaktionsmischungen wurde mit einem Shimadzu UV-1800-Spektrophotometer (Cole-Parmer India) erfasst. Die Reaktionen wurden in 1-ml-Quarzküvetten (Shilpent Quartz Cuvette, Frankreich) durchgeführt und die Absorption bei 340 nm wurde in Intervallen von 30 Sekunden 15 Minuten lang bei 25 °C aufgezeichnet. Alle Reaktionen wurden dreifach durchgeführt und die GST-spezifische Aktivität wurde als μM/ml/min berechnet, indem 9,6 mM−1 als Extinktionskoeffizient für das CDNB-GSH-Konjugat bei 340 nm verwendet wurde.

Die Gesamtlipaseaktivität wurde mithilfe des p-Nitrophenylpalmitat-Assays (pNPP, Sigma-Aldrich) geschätzt30. Lösung A besteht aus 0,1 g Gummi Arabicum und 0,4 ml Triton X-100 (Hi-media, Indien), gelöst in 90 ml destilliertem Wasser, und Lösung B enthielt 30 mg pNPP, gelöst in 10 ml Isopropanol31. Die vollständige Substratlösung wurde durch tropfenweise Zugabe von 9,5 ml Lösung A zu 0,5 ml Lösung B unter ständigem Rühren hergestellt, um eine Emulsion zu erhalten, die zwei Stunden lang stabil war. Mit diesem Substrat wurde die Lipaseaktivität bestimmt. Der Substratlösung wurden 40 μg HEP zugesetzt und sie wurde 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 % Natriumcarbonat (Na2CO3) gestoppt und die Absorption der Proben wurde bei 410 nm gemessen.

P-Nitrophenylphosphat und Leucin-p-Nitroanilid (Sigma-Aldrich) wurden als Substrate zum Nachweis spezifischer ALP- und APN-Enzymaktivitäten gemäß Protokoll32 verwendet. 40 μg HEP wurden mit ALP-Puffer [0,5 mM MgCl2, 100 mM Tris/HCl (pH 9,5)] bestehend aus 1,25 mM p-Nitrophenylphosphat oder APN-Puffer [0,2 M Tris/HCl (pH 8), 0,25 M NaCl] gemischt. mit 1 mM Leucin-p-nitroanilid. Die ALP-Enzymaktivität wurde als Änderung der Absorption bei 450 nm über 3 Minuten bei 25 °C überprüft, während die APN-Enzymaktivität bei 410 nm durch Überprüfen der Erzeugungsrate von p-Nitroanilin gemessen wurde.

Der Student-t-Test wurde für die statistische Analyse verwendet und das Signifikanzniveau wurde durch Vergleich mit den Messwerten der EV-Kontrolle als *P < 0,05, **P < 0,001 und ***P < 0,0001 angegeben. Die Diagramme wurden mithilfe einer Online-Demoversion von Graphpad Prism und Microsoft Excel erstellt. Das Modelbild wurde mit Biorender.com erstellt.

Das rekombinant exprimierte CanDef-20-Protein zeigte eine Molekülmasse von ~ 14 kDa und ihr Dot-Blot-Assay mit Anti-Myc-Antikörpern bestätigte das Vorhandensein und die Expression der rekombinanten Proteine ​​(Abb. 1a, b). Die Originalbilder von Gelen und Dot-Blot sind in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt. Die Wirkung von CanDef-20 auf die Entwicklung von H. armigera wurde durch Messung der Larvenmasse, Puppenmasse, Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeit bei Insekten bewertet, die mit verschiedenen Dosen des rekombinanten Proteins in künstlicher Nahrung gefüttert wurden (15,5, 31,25, 62,25, 125 und). 250 μg/ml). H. armigera-Larven, die rekombinantes CanDef-20 aufnahmen, zeigten im Vergleich zu den Larven, die Kontrollfutter (EV- und AD-gefüttert) aufnahmen, einen dosisabhängigen Effekt auf die Larvenmasse (ergänzende Abbildung S2). Eine maximale Verringerung der Larvenmasse (37 %) wurde beobachtet, wenn den Larven 125 μg/ml CanDef-20-haltiges Futter verabreicht wurde (Abb. 2a). In ähnlicher Weise wurde auch bei den mit CanDef-20 gefütterten Larven eine Verringerung der Puppenmasse (4% bis 12%) beobachtet (Abb. 2b und ergänzende Abb. S2). Interessanterweise zeigten H. armigera-Larven bei der Aufnahme von 250 μg/ml CanDef-20 einen leichten, aber signifikanten Anstieg der Larven- und Puppenmasse im Vergleich zu Larven, die 125 μg/ml CanDef-20 aufnahmen, obwohl die Masse immer noch geringer war als bei der Aufnahme der EV-Kontrolle Larven. Darüber hinaus wurde bei Insekten, die mit 125 und 250 μg/ml CanDef-20 gefüttert wurden, eine Verzögerung der Verpuppung um etwa 48–72 Stunden beobachtet. Die Eiablage und das Schlüpfen der Eier waren auch bei H. armigera-Motten beeinträchtigt, die aus Larven stammten, die mit höheren Konzentrationen von CanDef-20 gefüttert wurden. Bei der Gesamtzahl der Eier, die von H. armigera-Motten gelegt wurden, die aus mit CanDef-20 gefütterten Larven gezogen wurden, wurde eine Verringerung um 12–21 % beobachtet (Abb. 2c). Es wurde festgestellt, dass die Eifruchtbarkeit von 13 auf 68 % verringert war. Die Fütterung mit 250 μg/ml CanDef-20 führte zu der niedrigsten Anzahl (440) von Neugeborenen pro 1.000 Eiern (Abb. 2d). Larven, die sich mit CanDef-20-Diäten von 62,25 μg/ml ernährten, zeigten bei allen getesteten Konzentrationen eine hohe Mortalität (24 %) (Abb. 2e). Die durch die Einnahme von CanDef-20 induzierte Verringerung der Larven- und Puppenmasse war auch aus den vergleichenden Morphologien der H. armigera-Larven im späten fünften Stadium und ihrer Puppen ersichtlich (Abb. 2f). Bei den mit CanDef-20 gefütterten Larven wurde eine 24–72-stündige Verzögerung der Verpuppung beobachtet. Der Tag, an dem ~ 70 % der Larven zur Verpuppung gelangten, ist in Abb. 2f dargestellt. Die verzögerten Metamorphoseeffekte von CanDef-20 auf die Larven und Puppen von H. armigera werden auch in einem separaten Larven-Bioassay mit 150 μg/ml und 300 μg/ml CanDef-20 deutlich (ergänzende Abbildung S2).

Die SDS-PAGE- und Dot-Blot-Analyse rekombinanter CanDef-20- und EV-Proteine: (a) CanDef-20-, EV-Protein- und Protein-Molekulargewichtsleiter (Spur M, Genei Laboratories Private Limited) wurden auf 15 % SDS-PAGE aufgelöst und visualisiert durch Coomassie-Blau-Färbung. (b) Der primäre Kaninchen-Anti-Myc-Antikörper wurde gegen das Myc-Epitop des pPICZ-alpha A-Vektors in der Dot-Blot-Analyse verwendet. Der mit dem Western Blot Development Kit (Bangalore Genie, Indien) bereitgestellte Sekundärantikörper wurde zur Visualisierung des myc-markierten Primärantikörperkomplexes verwendet.

Wachstum und Entwicklung von H. armigera im CanDef-20-Fütterungstest im Vergleich zur Kontroll- (AD) und EV-Kontrolldiät: (a, b) Die prozentualen Verringerungen der Larven- und Puppenmasse von H. armigera werden jeweils durch Balkendiagramme angezeigt. (c) Die Wirkung der CanDef-20-Fütterung auf die Fruchtbarkeit von H. armigera-Larven wird durch die prozentuale Abnahme durch die jeweiligen Behandlungen gezeigt. (d) Die Anzahl der geschlüpften Neugeborenen pro 1.000 Eier wurde für jede Behandlung aufgezeichnet. (e) Die durch unterschiedliche Konzentrationen von CanDef-20 in H. armigera-Larven induzierte Mortalität. (f) Die morphologischen Variationen im späten fünften Larvenstadium von H. armigera und ihren Puppen deuteten auf die ausgeprägte Wirkung von CanDef-20 auf das Larven- und Puppenwachstum hin. Die prozentuale Verringerung der Larven- und Puppenmassenwerte unterscheidet sich deutlich von der EV-Kontrolle bei * für P < 0,05, ** für P < 0,001 bzw. *** für P < 0,0001.

Die Fütterungsexperimente zeigten eine dosisabhängige Verringerung der Larven- und Puppenmasse von H. armigera bei Aufnahme von bis zu 125 μg/ml CanDef-20-haltiger Nahrung. Die H. armigera-Larven im 4. Larvenstadium, die 9 Tage lang mit 125 μg/ml CanDef-20 oder mit EV-Protein enthaltender Diät gefüttert wurden, wurden für eine vergleichende transkriptomische Analyse unter Verwendung von RNA-seq verwendet.

Die Illumina-Sequenzierung von H. armigera-Bibliotheken ergab 1091,8 bzw. 1278,1 Millionen Lesepaare für mit CanDef-20- bzw. EV-Diät gefütterte Larven. Die De-novo-Assemblierungsanalyse sauberer Lesevorgänge ergab insgesamt 1.57.768 Transkripte, von denen 65.535 assemblierte Transkripte (41 %) eine Länge von > 200 bp aufwiesen und mit UniProtKB-Insektendaten annotiert wurden, was zu 13.779 Transkriptanmerkungen führte (Tabelle 1). Von den 13.779 annotierten Transkripten zeigten 6982 eine Abfrageabdeckung von > 75 % und diese wurden für eine weitere vergleichende Transkriptomanalyse von DEGs zwischen CanDef-20 und mit EV gefütterten H. armigera-Larven verwendet. Von den 6982 Genen stimmten 47 % mit der Gattung Heliothis und 6,19 % mit der Gattung Helicoverpa überein. Die Anwendung der Kriterien log2FC ≥ ± 2 mit P-Wert ≤ 0,05 und FDR ≤ 0,05 auf die 13.779 Transkripte führte zur Erkennung von Transkripten aus dem Jahr 2012, von denen 56 Transkripte als hochreguliert und 529 als herunterreguliert befunden wurden.

Bei Anwendung der Kriterien log2FC ≥ + 0,8 und ≤ − 0,8 Verhältnisse auf 6982 Transkripte mit > 75 % Abfrageabdeckung wurde festgestellt, dass 2327 (33,32 %) Gene bei CanDef-20 herunterreguliert und 659 (9,4 %) Gene hochreguliert waren Füttern. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass 1679 Gene in mit CanDef-20 gefütterten Larven eindeutig exprimiert wurden und 1545 Gene in mit EV-Kontrolle gefütterten Larven eindeutig exprimiert wurden.

Die BUSCO-Analyse wurde auf alle zusammengestellten Transkripte angewendet und ergab, dass 19 % vollständig waren (154 vollständige und Einzelkopie-BUSCOs, 39 vollständige und duplizierte BUSCOs), während 24 % fragmentiert waren (243 BUSCOs) und 57 % fehlten (577 BUSCOs). von 1013 Einzelkopie-Orthologen für Arthropoden (Ergänzungstabelle S4).

Das gesamte Genexpressionsmuster in den Kontroll- und mit CanDef-20 gefütterten Larven wurde durch hierarchische Clusterbildung bestimmt und die Ergebnisse zeigten eine deutliche Herunterregulierung der meisten Gene in mit CanDef-20 gefütterten H. armigera (Abb. 3a). Das Vulkandiagramm zeigte eine signifikante unterschiedliche Regulierung von 1702 von 1921 Transkripten mit einem P-Wert ≤ 0,05 (Abb. 3b; Tabelle 2). Die Analyse mit ≥ zweifachen Kriterien mit P-Wert ≥ 0,05 und FDR ≥ 0,05 zeigte, dass Juvenilhormon-bindendes Protein (JHBP), Hexamerin, Serinprotease, Arylphorin und Calphotin-Transkripte unter den stark herunterregulierten Transkripten vertreten waren, während die Reverse-Transkriptase-Domäne mutmaßlich Protein enthielt Nuklease HARBI1, Carbonsäureesterhydrolase und Tyrosin-3-Monooxygenase waren unter den stark hochregulierten Transkripten vertreten (Abb. 3c und 3d; ergänzende Abb. S3; ergänzende Tabelle S1). Außerdem wurden Juvenilhormon-supprimierendes Protein, Serinprotease und einige Isoformen der Glutathion-S-Transferase ausschließlich in EV-Kontrolllarven mit sehr hohen FPKM-Werten im Bereich von 6054–1386 gefunden, während dies bei einigen Isoformen der Argininkinase, der Endonuklease-Reverse-Transkriptase und der Serinprotease der Fall war wurde eindeutig in mit CanDef-20 gefütterten Larven nachgewiesen und hatte hohe FPKM-Werte im Bereich von 211–83. Ein einzelnes Transkript von GST wurde hochreguliert (TRINITY_DN83033_c9_g1_i1 mit FPKM 2,44) und eine andere Isoform von GST (TRINITY_DN82857_c2_g2_i2 mit FPKM 8,44) wurde auch unter den Genen gefunden, die nur in mit CanDef-20 gefütterten H. armigera-Larven exprimiert wurden.

Transkriptomanalyse: (a) Hierarchische Clusteranalyse unterschiedlich exprimierter Gene zwischen mit CanDef-20 gefütterten und mit EV-Kontrolle gefütterten H. armigera-Larven. (b) Das Vulkandiagramm zeigt eine statistisch signifikante Genexpression. Die Abwärts- und Aufwärtsregulierung wurde durch grüne bzw. rote Punkte gekennzeichnet. (c) und (d) Die Top 25 herunter- und hochregulierten DEGs werden jeweils im Kreisdiagramm dargestellt. Die Anzahl der für ein bestimmtes Gen aufgetretenen Transkripte wird angegeben.

Eine vergleichende GO-Anreicherung für differentiell exprimierte Gene mit den Verhältniskriterien log2FC ≥ + 0,8 und ≤ – 0,8 wurde durchgeführt und die Top-10-GOs sind dargestellt (Abb. 4 und 5). Die Mehrheit der Top-10-GOs aus dem differenziell exprimierten Satz wurde durch herunterregulierte Gene in H. armigera bei der Einnahme von CanDef-20 repräsentiert (mit Ausnahme der GO-Nukleinsäurebindung, die hochreguliert wurde) (Abb. 4); während der einzigartig exprimierte Satz durch die Mehrheit der durch CanDef-20 induzierten Gene repräsentiert wurde (Abb. 5). Es wurde festgestellt, dass es sich bei den mit CanDef-20 gefütterten Larven um integrale Bestandteile der Membran, der ATP-Bindung und der Translation handelt, die am häufigsten unterschiedlich regulierten GOs sind (Abb. 4a). Die Unterkategorien der am stärksten unterschiedlich regulierten GOs sind in Abb. 4b dargestellt. GO ATP-Bindung unterteilt in ATP-abhängige enzymatische Prozesse wie Proteinkinase, Proteasom-aktivierende ATPase und Helikase; während die integrale GO-Komponente der Membran Sub-GOs wie mitochondriale Membran-assoziierte Gene, Signalpeptidase-Komplex, protonentransportierende V-Typ-ATPase, Plasmamembran und Mikrotubuli-Tethering-Komplex umfasste. Einzigartig exprimierte GOs zeigten eine herausragende Rolle als integraler Bestandteil der Membran, der ATP-Bindung und des Kohlenhydratstoffwechselprozesses (Abb. 5a und b).

Genontologische Anreicherung von DEGs von mit CanDef-20 gefütterten Insekten im Vergleich zur EV-Kontrolle: (a) Genontologische (GO) Klassifizierung von Transkripten in drei Kategorien wie molekulare Funktion, zelluläre Komponente und biologischer Prozess. Die X-Achse entspricht der Anzahl der in der Analyse aufgetretenen DEGs, während die Y-Achse verschiedene GOs darstellt. Rote und blaue Balken zeigen eine Abwärts- bzw. Aufwärtsregulierung an. (b) Die Unterkategorisierung der obersten GO wird weiter analysiert und in Form eines Kreisdiagramms dargestellt. Der Name und das Vorkommen von sub GO werden angegeben.

Genontologische Anreicherung von DEGs von eindeutig in CanDef-20 und EV gefütterten Insekten exprimiert: (a) Genontologische (GO) Klassifizierung von Transkripten in drei Kategorien wie molekulare Funktion, zelluläre Komponente und biologischer Prozess. Die X-Achse entspricht der Anzahl der in der Analyse aufgetretenen DEGs, während die Y-Achse verschiedene GOs darstellt. Rote und blaue Balken zeigten einen einzigartigen Ausdruck bei der EV-Kontrolle bzw. bei der Verabreichung von CanDef-20. (b) Die Unterkategorisierung der obersten GO wird weiter analysiert und in Form eines Kreisdiagramms dargestellt. Der Name und das Vorkommen von sub GO werden angegeben.

Einige prominente GOs, nämlich Kinasen, ATPasen, Serin-Endopeptidasen, integrale Membrankomponenten, Lipasen und Transposons, traten sowohl in unterschiedlich exprimierten als auch in eindeutig exprimierten Sätzen auf. Es wurden verschiedene Isoformen der oben genannten Gene nachgewiesen und es wurde festgestellt, dass sie unterschiedliche Expressionsniveaus aufweisen, wie in den Heatmaps dargestellt (Abb. 6a und b; Ergänzungstabelle S2). Herunterregulierte Isoformen von Genen wurden durch wenige hochregulierte Isoformen ausgeglichen, was auf eine durch CanDef-20 induzierte kompensatorische Reaktion in H. armigera hinweist. Beispielsweise wurde festgestellt, dass in GO-transponierbaren Elementen die Isoformen stark hochreguliert waren, während in der GO-Lipase interessanterweise nur drei Isoformen hochreguliert (LP1, TLP und LP2) und > 15 herunterreguliert waren. LP1 und TLP sind nicht aus H. armigera charakterisiert (Ergänzungstabelle S2), obwohl sie Homologie mit Lipase-1 (NM_001043501.1) bzw. Triacylglycerol-Lipase (XM_038014482.1) zeigten, die in Bombyx mori gefunden wurden. Die dritte (LP2) hochregulierte Lipase weist Homologie mit den Triacylglycerin-Lipasen von H. armigera (XM_047184139.1) auf.

Differenzielles und einzigartiges Expressionsmuster einiger ausgewählter Genkategorien: (a) Die durch CanDef-20 induzierte unterschiedliche Regulation von H. armigera-Genen ausgewählter GOs wird durch die Heatmaps dargestellt. Verschiedene Genisoformen von Kinasen, ATPasen, Serin-Endopeptidasen (SEP), integralen Membrankomponenten (ICM), Lipasen und Transposons (TRSP) werden auf der Grundlage der log2-fachen Änderung dargestellt. Die Abwärts- und Aufwärtsregulierung wird durch einen grünen bzw. roten Farbverlauf angezeigt. (b) Das einzigartige Expressionsmuster verschiedener Genisoformen von Kinasen, ATPasen, Serin-Endopeptidasen (SEP), integralen Membrankomponenten (ICM), Lipasen und Transposons (TRSP) wird in mit CanDef-20 und EV-Kontrolle gefütterten Larven separat nachgewiesen und dargestellt durch die Heatmaps. Das einzigartige Expressionsmuster in mit CanDef-20 gefütterten Larven wird durch den roten Farbverlauf dargestellt. Der grüne Farbverlauf wird verwendet, um die einzigartige Expression bei mit EV gefütterten Larven zu zeigen.

HEP von mit CanDef-20 gefüttertem und mit EV-Kontrollprotein gefüttertem H. armigera wurde auf den Nachweis von Amylase-, Protease-, Lipase-, GST-, Aminopeptidase- und alkalischer Phosphatase-Aktivitäten analysiert (Abb. 7). Bei den mit CanDef-20 gefütterten Larven wurde ein signifikanter Anstieg der Gesamtenzymaktivitäten aller dieser Enzyme festgestellt. Amylase, Protease, GST und Aminopeptidase zeigten einen Anstieg von etwa 50–63 %, während Lipasen und alkalische Phosphatasen bei mit CanDef-20 gefütterten Larven einen Anstieg von 35 % bzw. 24 % zeigten. Die RNA-Seq-Daten hatten auf eine deutliche Herunterregulierung der meisten Isoformen der Gene dieser Enzyme als Reaktion auf die Candef-20-Fütterung hingewiesen (Abb. 6). Es wurde jedoch festgestellt, dass einige spezifische Enzymisoform-kodierende Gene für alle ausgewählten Enzyme (außer Amylasen) hochreguliert sind. Diese selektiv hochregulierten Enzymisoformen-kodierenden Gene hätten am deutlichsten zum Anstieg der Netto-In-vitro-Aktivität dieser Enzyme beigetragen.

Auswirkung der CanDef-20-Fütterung auf die Enzymaktivitäten: Das H. armigera-Enzympräparat (HEP) wurde in den Tests zum Nachweis von (a) Amylase, (b) Protease, (c) Lipase, (d) Glutathion-S-Transferase verwendet ( GST), (e) Aminopeptidase- und (f) alkalische Phosphatase-Enzymaktivitäten und wird durch ein Balkendiagramm angezeigt. Die Enzymaktivitäten aus künstlicher Nahrung (AD), rekombinanter CanDef-20-inkorporierter Nahrung (CanDef-20) und leeren Vektor-exprimierten Proteinen (EV) wurden analysiert. Die Gesamtenzymaktivitätswerte unterscheiden sich deutlich von der EV-Kontrolle bei * für P < 0,05, ** für P < 0,001 bzw. *** für P < 0,0001.

Die relativen Genexpressionsniveaus von JHBP, Hexamerin, Calphotin, Kinasen, ATPasen, integralen Membrankomponenten, Lipasen, Serin-Endopeptidasen und Transposons wurden an mit CanDef-20 gefütterten H. armigera-Larven (bei 125 μg/ml und 250 μg/ml) untersucht EV-Kontrolle durch RT-qPCR (Einzelheiten zum Primer finden Sie in der Ergänzungstabelle S3). Es wurde festgestellt, dass die Genexpression von JHBP, Hexamerin und Calphotin in H. armigera bei Einnahme von CanDef-20 herunterreguliert ist, was mit den RNA-seq-Daten übereinstimmt (Abb. 8a).

Validierung der RNA-seq-Genexpression durch qPCR-Analyse: Zur Validierung der RNA-seq-Daten wird eine qPCR-Analyse für ausgewählte Gene durchgeführt. (a) Juvenile Hormonbindungsprotein (JHBP), Hexamerin, Calphotin, Argininkinase, Pyruvatkinase, Adenylatkinase 6, (b) V-Typ-Protonen-ATPase und ihre Untereinheiten C und B. (c) Aminopeptidase 2, alkalische Phosphatase 2 und Aminopeptidase (d) N-Lipase, Lipase (LP2), Lipase. (e) Trypsin, Serinprotease. (f) ATP-Synthase. (g) Endonuklease-Reverse-Transkriptase (ERT 4, ERT 12 und ERT 2). Die relativen Genexpressionswerte unterscheiden sich signifikant von der EV-Kontrolle bei * für P < 0,05, ** für P < 0,01, *** für P < 0,001 bzw. nd für keinen Unterschied.

Die Isoformen von Arginin-Kinase, Pyruvat-Kinase, V-Typ-ATPase und ihrer Untereinheit C wurden herunterreguliert, und dies steht im Einklang mit den RNA-seq-Daten, aber Adenylat-Kinase und V-Typ-ATPase-Untereinheit B zeigten unterschiedliche Expressionsniveaus in qPCR im Vergleich zu RNA -seq-Analyse (Abb. 8a, b).

Die Genexpressionsniveaus von Isoformen von Membranproteinen wie Aminopeptidase, alkalischer Phosphatase 2 und Mucin wurden ebenfalls herunterreguliert und stimmen mit den RNA-seq-Daten überein (Abb. 8c).

Es wurde festgestellt, dass verschiedene Isoformen von Lipasen (Lipase, N-Lipase und LP2), Serinprotease und Trypsin hoch- oder herunterreguliert sind, was mit ihren jeweiligen RNA-Seq-Daten übereinstimmt (Abb. 8d und e).

In ähnlicher Weise zeigte die ATP-Synthase auch eine Herunterregulierung der Genexpression, die mit den RNA-seq-Daten korrelierte (Abb. 8f). Die qPCR-Analyse zeigte ein kontrastierendes Expressionsmuster aller getesteten Isoformen der Endonuklease-Reverse-Transkriptase-Gene (ERT4, 12 und 2) mit ihren RNA-seq-Daten (Abb. 8g).

Pflanzen nutzen ein Arsenal an Biomolekülen, um eine Abwehrreaktion gegen Schädlinge und Krankheitserreger auszulösen. Einige dieser Moleküle sind zielspezifisch, andere haben eine breite Wirkung. Pflanzliche Defensine sind vor allem für ihre antimykotischen Eigenschaften bekannt33, obwohl sie auch das Potenzial haben, das Wachstum von Insekten zu verzögern. In der vorliegenden Studie führte die Einnahme eines Defensins aus C. annuum (rekombinantes CanDef-20) zu einer dosisabhängigen negativen Wirkung auf das Wachstum und die Entwicklung des Insektenschädlings H. armigera, ähnlich wie bei der zuvor berichteten Lepidopteren- und Coleopteren-Insektenantibiose34,35. H. armigera, der mit sehr hohen Konzentrationen von CanDef-20 (250 µg/ml) gefüttert wurde, weicht vom Trend der dosisabhängigen Verringerung der Larvenmasse ab, was höchstwahrscheinlich auf die durch Defensin induzierten adaptiven molekularen Reaktionen zurückzuführen ist (weiter erläutert).

Obwohl die Verzögerung des Insektenwachstums eine herausragende Auswirkung der Ernährung mit defensinhaltiger Nahrung ist, sind die molekularen Mechanismen, die an den durch pflanzliches Defensin vermittelten Stoffwechselveränderungen bei Insekten beteiligt sind, wie z. B. verzögerte Lebensstadien, Wachstumsverzögerung, Massenreduzierung und Fruchtbarkeitsverlust, weitgehend unbekannt. Die vergleichende Transkriptomik ergab Veränderungen in Signalwegen und Prozessen, die durch die Aufnahme von CanDef-20 in H. armigera-Larven hervorgerufen wurden. Es ist bekannt, dass AMPs wie Defensine mit verschiedenen Zellkomponenten wie Zellmembranen und zytoplasmatischen Proteinen interagieren und auch in den Zellkern eindringen und mit der DNA interagieren können36,37,38,39. Die Einnahme des CanDef-20-Peptids vermittelt mehrere Auswirkungen auf den H. armigera-Metabolismus durch Wechselwirkung(en) zwischen Defensin und sezerniertem Protein/Enzym, Wechselwirkungen zwischen Defensin und Membran und Defensin-induzierter Regulierung der Zielgenexpression (Abb. 9).

Modelldiagramm, das die metabolische Neuprogrammierung/Wege darstellt, die durch die Aufnahme von CanDef-20 in H. armigera beeinflusst werden: Ausgewählte Genkategorien wie Transposons, Kinase, integrale Komponenten der Membran, Serin-Endopeptidase, Lipase, ATPase werden gezeigt und die Rolle der Schlüsselproteine, die an dem Prozess beteiligt sind, wird gezeigt hervorgehoben. Die Herunter- und Hochregulierung spezifischer Proteine ​​und Enzyme wird durch rote bzw. blaue Pfeile dargestellt.

Eine der bekannten Wirkungsweisen pflanzlicher Defensine bei Insekten besteht in der Hemmung ihrer Verdauungsenzyme wie Amylasen und Proteinasen17,40,41,42. In der vorliegenden Studie zeigten mit CanDef-20 gefütterte Larven höhere Darmamylase- und Proteinaseaktivitäten. Die Transkriptomdaten zeigten jedoch eine deutliche Herunterregulierung der Alpha-Amylase- und Serin-Endopeptidase-Transkripte (Serinproteasen und Trypsin) und eine bemerkenswerte Hochregulierung einiger Isoformen von Chymotrypsin und Serinprotease. Dies deutete auf kompensatorische Stoffwechselanpassungen von H. armigera hin, um die Verdauung in Gegenwart von CanDef-20 auszugleichen. Bei Insekten kommt es häufig zu Anpassungen der Expression von Proteinase-Isoformen auf Gen- und Transkriptebene, wenn sie Proteinase-Inhibitoren ausgesetzt werden43,44. In ähnlicher Weise modulieren Darmamylaseenzyme ihre Expression als Reaktion auf die Einnahme pflanzlicher Amylasehemmer45.

Über das Insektenlipase-hemmende Potenzial pflanzlicher Defensine wurde bisher nicht berichtet, obwohl wir bei der Einnahme von CanDef-20 eine Herunterregulierung der meisten H. armigera-Lipase-Transkripte (neutrale Lipase, Lipasen und Triacylglycerol-Lipasen) festgestellt haben. Außerdem wurde ein gleichzeitiger Nettoanstieg der Lipaseaktivität in mit CanDef-20 gefütterten Larven beobachtet, der auf die kompensatorisch hochregulierten Lipase-Transkript-Isoformen LP1, LP2 und TLP (klassifiziert unter Carbonsäureesterhydrolase-Aktivität [GO:0052689]) zurückzuführen ist. Carbonsäureesterhydrolasen sind auch an der Entgiftung mehrerer Insektizide beteiligt, die bei Insekten zur Resistenzentwicklung führen46. Es ist auch bekannt, dass verschiedene Isoformen von Lipaseenzymen für die Lipidmobilisierung bei Insekten unter Hungerstress benötigt werden47. TAG-Lipasen und eine Phospholipase werden während des Hungerns in D. melanogaster hochreguliert und könnten an der Lipidmobilisierung beteiligt sein48,49. Somit scheint die Einnahme von CanDef-20 bei H. armigera hungerähnlichen Stress und Toxinstress auszulösen, der sich weiter in einer unterschiedlichen Lipaseexpression und einem durch Carbonsäureesterhydrolase vermittelten Lipidabbau äußert.

Die verfügbaren genomischen und transkriptomischen Ressourcen für H. armigera reichen nicht aus, um den Bereich der bei der Einnahme von CanDef-20 exprimierten Transkripte abzubilden, da 64 % der in der vorliegenden Studie identifizierten differentiell exprimierten Transkripte nicht charakterisierte Gene sind. Die kürzlich veröffentlichte H. armigera-Genomressource50 könnte nützlich sein, um einige der nicht charakterisierten Gene aus der vorliegenden Studie zu kommentieren.

Jüngste Studien haben gezeigt, dass Defensine mit mikrobiellen Krankheitserregern und/oder Tumorzellmembranen interagieren, indem sie an spezifische Phospholipide binden, um eine Membranpermeabilisierung zu bewirken, die zum Zelltod führt38,51,52. Der Mechanismus der Membranzerstörung variiert je nach Membranzusammensetzung und interagierenden Defensinmolekülen. Die Kinetik der Pilzmembraninteraktion ist für zwei pflanzliche Defensine bekannt: (i) Erbsen-Defensin PsD1, das mit Membranen interagiert, die das Sphingolipid Glucosylceramid (GluCer)53 enthalten, und (ii) MtDef4 aus Medicago truncatula, das mit Membranphosphatidsäure (PA) interagiert15. Wir haben festgestellt, dass integrale Bestandteile der Membran (GO: 0,016,021) ein stark herunterreguliertes GO in mit CanDef-20 gefütterten H. armigera-Larven sind und Membranproteine ​​wie V-Typ-Protonen-ATPasen (V-ATPasen), Cadherin, ALP und APN darstellen Proteine.

V-ATPasen sind Transmembran-Protonenpumpen, die bei zahlreichen biologischen Prozessen eine wichtige Rolle spielen, wie z. B. Proteinabbau und -synthese, Verschiebungen des Organellen-pH-Werts, Zellwachstum und Zellautophagie54. Die Einnahme von CanDef-20 würde zu einer Störung der zellulären Energiehomöostase in H. armigera führen, die mit der Herunterregulierung von V-ATPasen korreliert werden kann. V-ATPasen und ihre Untereinheit wurden während des Hungerns im Tabakschwärmer Manduca sexta55 herunterreguliert. Interessanterweise verringerte die auf V-ATPase in H. armigera abzielende RNAi die Larvenmasse und die Überlebensfähigkeit der Larven56, was mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit korreliert.

Cadherin-, ALP- und APN-Proteine ​​sind funktionelle Rezeptoren für das Cry1A-Toxin in Helicoverpa armigera und ihre Wechselwirkung mit dem Cry-Toxin vermittelt die Porenbildung in der Darmmembran, was zum Tod von Insekten führt5. Die Herunterregulierung dieser Rezeptoren und die Expression ihrer mutierten Isoformen führt bei Schmetterlingsinsekten zur Entwicklung einer Resistenz gegen das Cry1A-Toxin4,57,58. Die durch die Einnahme von CanDef-20 verursachte Herunterregulierung der Cadherin-, ALP- und APN-Rezeptoren in H. armigera weist auf die toxische Wirkung von CanDef-20 hin. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass Transkripte von mutiertem Cadherin und einigen Isoformen von ALP und APN in H. armigera bei der Einnahme von CanDef-20 hochreguliert werden, was Ähnlichkeiten in den durch Cry1A-Toxin und CanDef-20 ausgelösten Prozessen aufzeigt. Eine ähnliche gleichzeitige Herunterregulierung von APN1 und kompensatorische Hochregulierung von APN6 wird bei der Cry1A-resistenten Kohlpflanze Trichoplusia ni6 berichtet.

GSTs sind die anderen Enzyme mit xenobiotischem Entgiftungspotential59. Die Herunterregulierung mehrerer GST-Isoformen und die selektive Hochregulierung von zwei GST-Isoformen bei der Aufnahme von CanDef-20 in H. armigera weist auch auf den toxischen Stress von CanDef-20 und die entsprechende adaptive Reaktion des Insekts hin, was auch durch eine hohe GST-Proteinaktivität dargestellt wird ( Abb. 7).

Die Einnahme von CanDef-20 führt zu einer Veränderung der Expression einiger zytoplasmatischer Enzyme wie Argininkinase (AK), Pyruvatkinase (PK), Superoxiddemutase (SOD), Sperminoxidase und Chitinsynthase (CHS).

AK ist eine Phosphagenkinase von Wirbellosen, die am Transport und der Pufferung von Energie beteiligt ist, indem sie das zelluläre ATP/ADP-Verhältnis stabilisiert60. Eine RNA-Interferenz (RNAi)-Studie zur Bekämpfung von AK beim Coleoptera-Käfer Phyllotreta striolata führte zu Mortalität und Verlust der Fruchtbarkeit61. PK katalysiert die Phosphoenolpyruvat-zu-Pyruvat-Reaktion der Glykolyse, was zum TCA-Zyklus führt62. Die Hemmung der PK führt zu einem verringerten ATP-Spiegel und einem Ungleichgewicht im Energiestoffwechsel in Tribolium castaneum63. Niedrige Pyruvatwerte im Puppengehirn von H. armigera führten zu einer Verlängerung der Lebensdauer durch Auslösen der Diapause64. Die verringerte Larven- und Puppenmasse sowie die verzögerte Verpuppung bei mit CanDef-20 gefüttertem H. armigera könnten mit der Herunterregulierung von AK und PK korrelieren.

Pflanzliche Defensine können zelluläre Effekte hervorrufen, einschließlich der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), die sekundäre Signale und ein Ungleichgewicht der Ionenhomöostase auslösen und letztendlich zum Zelltod beitragen65. Das SOD-Enzym hilft bei der Bekämpfung der ROS-Erzeugung66. Pflanzliche Defensine wie RsAFP2 und Vu-Defr sind auch in der Lage, ROS bei Candida albicans67 bzw. Leishmania amazonensis68 zu induzieren. Eine Hochregulierung von SOD bei der Aufnahme von CanDef-20 in H. armigera impliziert, dass Defensin oxidativen Stress in den Larven erzeugt und die erhöhte SOD-Expression ROS-Stress lindert.

Eine Beeinträchtigung der Aktivität der ribosomalen Maschinerie kann das Wachstum und die Entwicklung von Insekten beeinträchtigen69. Bei Drosophila wird das Transkriptniveau der Ribosomen und der Proteinsynthese durch den Mangel an Aminosäuren in der Nahrung herunterreguliert70. Die Abnahme des Transkriptniveaus von Ribosomen ist das Ergebnis von Nährstoffstress durch die CanDef-20-Fütterung durch H. armigera.

CHS erhält die Integrität der Chitinmatrix aufrecht und reguliert die Metamorphose von Larven zu Puppen, das Schlüpfen von Eiern und die Fruchtbarkeit71. Die Stummschaltung der CHS-Gene führte zu missgebildeten Phänotypen und einer erhöhten Mortalität mit verringerter Häutungsrate bei der Nymphe von Locusta migratoria manilensis72 und der Eiablage bei der Roten Vogelmilbe Panonychus citri73. Die Verlängerung der Larvenperiode und die Verringerung der Eiablage können eine Folge der Herunterregulierung des CHS-Gens in mit CanDef-20 gefütterten H. armigera-Larven sein (Abb. 2).

Juvenilhormon-bindendes Protein (JHBP) ist in Verbindung mit Juvenilhormon (JH) und Speicherproteinen wie Hexamerin, Arylphorin und Apolipophorin für mehrere physiologische Prozesse bei Insekten, einschließlich Larvenentwicklung, Metamorphose und Fortpflanzung bei Erwachsenen, essentiell74. Es wird berichtet, dass eine Herunterregulierung von JHBP zu Entwicklungsverzögerungen bei H. armigera-Larven führt74. Außerdem wurde festgestellt, dass Hexamerin beim Kiefernsägeblattkäfer (Monochamus alternatus) bei Fütterung mit Insektiziden (Chloraminphosphor) deutlich herunterreguliert war75, und Arylphorin war bei mit Vip3Aa-Toxin behandelten Larven von Spodoptera exigua76 herunterreguliert. Daher könnte eine Herunterregulierung von JHBP, Hexamerin und Arylphorin Auswirkungen auf die Metamorphose von H. armigera-Larven haben und zu einem verlängerten Larvenstadium führen. Gegenhochregulierte Transkripte von Proteinkinase, Serin-Threonin-Kinase und G-Protein-Rezeptoren helfen jedoch dabei, das Puppenstadium zu erreichen.

Endonuklease-Reverse-Transkriptase (Retrotransposons) und transponierbare Elemente (TEs) waren die am häufigsten vertretenen hochregulierten Transkripte in mit CanDef-20 gefütterten H. armigera-Larven. TEs tragen durch Insertionsmutagenese und Rekombination in der Nähe der funktionellen Gene zur Entstehung neuer Mutationen bei und sind für die Erzeugung eines Großteils der genetischen Vielfalt verantwortlich, die zu einer schnellen Evolution beiträgt77. Die Insertion von TEs in der Nähe von Entgiftungsgenen wie P450 verlieh H. zea-Motten und D. melanogaster-Fliegen die Anpassung und Resistenz gegenüber Insektiziden78. Die Transposon-Insertion in den Cadherin-Genen des Darmmembranrezeptors führt zu einer Bt-Resistenz beim Rosa Kapselwurm79. Wir beobachteten, dass die Fütterung mit CanDef-20 die Mobilisierung von TEs vom RNA-Typ wie LINE Jockey, LTR Gypsy und LINE RTE in H. armigera auslöste. H. virescens zeigte eine Hochregulierung von Retrotransposons und DNA-Transposons als Reaktion auf die Aufnahme von Glucosinolaten aus Arabidopsis thaliana80. Eine erhöhte Expression und Transposition von TEs als Reaktion auf CanDef-20 kann zu einer vererbbaren genetischen Vielfalt in H. armigera-Larven führen und den Insekten weitere selektive Vorteile verleihen, was weiterer Untersuchungen bedarf.

Störungen im Stoffwechsel im Larvenstadium aufgrund des Vorhandenseins von Inhibitoren oder Toxinen in der Nahrung beeinträchtigen häufig den Lebenszyklus des Larvenstadiums. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Einnahme von CanDef-20 bei H. armigera-Larven zu einer Hemmung des Larven- und Puppenwachstums führte. Eine vergleichende Transkriptomanalyse zeigte eine Herunterregulierung und unterschiedliche Hochregulierung von Genen, die an verschiedenen Stoffwechselwegen beteiligt sind, einschließlich der Energiehomöostase und Enzymen im Zusammenhang mit der Nahrungsverdauung sowie der xenobiotischen Entgiftung bei Exposition gegenüber CanDef-20. Wir kommen zu dem Schluss, dass die Verzögerung des Wachstums und der Entwicklung von H. armigera-Larven, die CanDef-20 aufnehmen, durch dessen Wechselwirkungen mit sekretierten Proteinen/Enzymen, Membrankomponenten und der Regulierung der Zielgenexpression vermittelt wird, die über Transkriptionsfaktoren und Transposons vermittelt wird. Unsere Studie bietet eine Grundlage für zukünftige Forschungen zu möglichen praktischen Anwendungen der durch Defensinpeptide vermittelten Bekämpfung schädlicher Schädlinge wie H. armigera.

Die während der aktuellen Studie generierten Transkriptom-Assemblierungsdaten sind bei SRA (NCBI-Datenbank) unter dem Bioprojekt PRJNA869208 verfügbar. Weitere Datendateien zur Transkriptomassemblierung sind unter Mendeley-Daten https://doi.org/10.17632/gwjdhw6rw3.1 verfügbar.

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JM und VT danken dem Department of Science and Technology (DST), dem Science and Engineering Research Board (SERB), der indischen Regierung für die Bereitstellung der Finanzierung (CRG/2018/002324) und dem Departmental Research and Development Program (DRDP), Institut für Bioinformatik and Biotechnology (IBB), Savitribai Phule Pune University (SPPU), Pune, Maharashtra, Indien für die Finanzierung und Unterstützung dieser Arbeit. Wir danken dem Leiter der Abteilung Mikrobiologie für die Erlaubnis, die qPCR-Maschine nutzen zu dürfen. Wir danken auch Herrn Onkar Ghuge und Frau Rutuja Shirke für ihre Hilfe bei der Pflege der Insektenkultur und des Enzymtests.

Abteilung für Biotechnologie (gemeinsam mit dem Institut für Bioinformatik und Biotechnologie (IBB) zusammengelegt), Savitribai Phule Pune University, Pune, Maharashtra, 411007, Indien

Javed A. Mulla und Vaijayanti A. Tamhane

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JM – Experimentieren, Datenanalyse, Zahlen und Manuskriptschreiben. VT – Betreuung, Konzeptualisierung, Datenanalyse, Zahlen und Verfassen des Manuskripts, Projektverwaltung und Finanzierungseinwerbung.

Korrespondenz mit Vaijayanti A. Tamhane.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mulla, JA, Tamhane, VA Neue Erkenntnisse über die durch die Einnahme von pflanzlichem Defensin induzierten Stoffwechselreaktionen beim polyphagen Insektenschädling Helicoverpa armigera. Sci Rep 13, 3151 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29250-3

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Eingegangen: 10. September 2022

Angenommen: 01. Februar 2023

Veröffentlicht: 23. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29250-3

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