Polychromatisches Polarisationsmikroskop: Farben in eine farblose Welt bringen

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 17340 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Interferenz zweier kombinierter weißer Lichtstrahlen erzeugt Newton-Farben, wenn einer der Strahlen gegenüber dem anderen um 400 nm bis 2000 nm verzögert ist. In diesem Fall addieren sich die entsprechenden interferierenden Spektralkomponenten als zwei Skalare bei der Strahlvereinigung. Liegt die Verzögerung unter 400 nm, entstehen durch die Zweistrahlinterferenz nur Grautöne. Die Interferenzfarben werden häufig zur Analyse doppelbrechender Proben in der Mineralogie verwendet. Viele biologische Strukturen weisen jedoch eine Verzögerung von <100 nm auf. Daher erscheinen Zellen und Gewebe unter einem normalen Polarisationsmikroskop als graues Bild, dessen Kontrast bei bestimmten Ausrichtungen verschwindet. Hier schlagen wir zum ersten Mal die Verwendung der Vektorinterferenz von polarisiertem Licht vor, bei der die Vollspektrumfarben mit einer Verzögerung von mehreren Nanometern erzeugt werden, wobei der Farbton durch die Ausrichtung der doppelbrechenden Struktur bestimmt wird. Die zuvor farblosen doppelbrechenden Bilder von Organellen, Zellen und Geweben werden lebendig gefärbt. Dieser Ansatz kann neue Möglichkeiten für die Untersuchung biologischer Proben mit schwach doppelbrechenden Strukturen, die Diagnose verschiedener Krankheiten, die Abbildung von Kristallen mit geringer Doppelbrechung und die Entwicklung neuer Methoden zur Steuerung der Farben des Lichtstrahls eröffnen.

Natürliches weißes Licht besteht aus einer Mischung monochromatischer Wellen mit Wellenlängen von 380 nm bis 700 nm1. Wenn der Lichtstrahl in zwei Teile aufgeteilt und dann wieder vereint wird, können wir Interferenzen beobachten. Jede monochromatische Welle erzeugt ihr eigenes Interferenzmuster. Einige Wellen erfahren destruktive Interferenz und ihre Intensität nimmt ab. Durch konstruktive Interferenz nimmt die Intensität anderer Wellen zu. Der kombinierte Strahl weist die Newtonschen Interferenzfarben auf. Der Farbton wird durch die Wellenlänge bestimmt, die aufgrund destruktiver Interferenz im Spektrum fehlt.

Es gibt zwei Arten von Interferenzfarben: eine mit einer anfänglichen Phasenverschiebung von Null zwischen zwei interferierenden Strahlen (weißer achromatischer Streifen, konstruktive Interferenz) und eine andere mit anfänglicher Phasenverschiebung einer Halbwelle (schwarzer achromatischer Streifen, destruktive Interferenz)2,3,4,5 . Sie erzeugen komplementäre Farbfolgen, die durch die Newtonsche Farbskala beschrieben werden. Die zweite Art von Interferenzfarben entsteht bei der Reflexion einer Seifenblase, zweier nahe beieinander liegender kugelförmiger und flacher Glasoberflächen (Newton-Farbringe), eines Ölflecks in einer Pfütze oder eines Ölflecks auf nassem Asphalt usw. Diese Art von Interferenz wird bei Interferenzen und anderen eingesetzt Polarisationsmikroskopie, da sie empfindlicher auf geringe Verzögerungsänderungen reagiert und weniger Schrotrauschen aufweist. Bei kleiner Verzögerung (<200 nm) wird die destruktive Interferenz für alle Wellenlängen gleichzeitig geschwächt und die Helligkeit des Bereichs nimmt zu, zunächst mit einer weißen spektralen Zusammensetzung. Aber sobald die Verzögerung 400 nm erreicht, wird der blaue Teil des Spektrums unterdrückt und die Probe wird gelb und dann rot. Sobald die Verzögerung 600 nm erreicht, wird der rote Teil des Spektrums ausgeblendet und die Probe wird blau und dann grün. Die Farbe ändert sich in dieser Reihenfolge noch dreimal, bis die Verzögerung 2000 nm erreicht. Dann werden die Interferenzfarben weiß und der Gangunterschied lässt sich anhand der spektralen Zusammensetzung der Region nicht mehr zuverlässig bestimmen. Die Färbung mit polarisiertem Licht wird seit vielen Jahren in großem Umfang in der Mineralogie und Petrographie eingesetzt6,7,8,9,10,11,12. Dieses Phänomen konnte jedoch bisher in der Biologie nicht genutzt werden, da viele biologische Proben eine Verzögerung von mehreren zehn Nanometern oder weniger aufweisen und daher farblos sind.

Wir haben ein neues polychromatisches Polarisationslichtmikroskop (polychromatisches Polscope) entwickelt, das Interferenzfarben mit einer Verzögerung von mehreren nm erzeugt. Herkömmliche Newton-Farben erfordern, dass die interferierenden Strahlen mit den gleichen Polarisationszuständen und Strahlamplituden als zwei Skalare addiert werden. Bei unserem Ansatz zur Erzeugung von Interferenzfarben nutzen wir die Strahlpolarisation und Amplituden der interferierenden Strahlen, die als zwei Vektoren addiert werden. Beim polychromatischen Polskop wird der Farbton durch die Ausrichtung der doppelbrechenden Struktur und nicht durch deren Verzögerung bestimmt. Somit kann eine Vollspektrumfarbe bei einer viel geringeren Verzögerung erreicht werden. Das polychromatische Polskop zeigt das orientierungsunabhängige Doppelbrechungsbild, ohne dass eine digitale Berechnung erforderlich ist. Ein Auge oder eine Kamera kann das farbige Polarisationsbild in Echtzeit direkt durch das Okular sehen, wobei die Helligkeit der Verzögerung und die Farbe der Ausrichtung der langsamen Achse entspricht. Zuvor farblose doppelbrechende Bilder von Organellen, Zellen und Geweben werden lebhaft gefärbt.

Das optische Design des polychromatischen Polskops basiert auf einem standardmäßigen Polarisationslichtmikroskop, das mit einem speziellen Spektralpolarisationszustandsgenerator und -analysator ausgestattet ist. Die zu untersuchende Probe wird mit weißem Licht beleuchtet, dessen Polarisation von der Wellenlänge abhängt. Die Probe verändert die Strahlpolarisation. Der Analysator könnte entweder orthogonal oder parallel zum Polarisationszustandsgenerator sein. Im ersten Fall blockiert der Analysator die Polarisation, die durch die Probe nicht verändert wird. So sind nicht doppelbrechende Probenteile schwarz und die doppelbrechenden Strukturen farbig. In der zweiten Konfiguration reduziert der Analysator alle vom Polarisationsgenerator erzeugten spektralen Polarisationszustände gleichermaßen. In diesem Fall erscheint der nicht doppelbrechende Bereich grau (neutral). Auch die Farben der doppelbrechenden Strukturen sind intensiver und nicht doppelbrechende Strukturen sind weiterhin in Grau sichtbar.

Ein Beispiel für das polychromatische Polskop ist in Abb. 1 dargestellt. Es besteht aus einer weißen Lichtquelle mit optionalem Bandpassfilter, einem polychromatischen Polarisationszustandsgenerator, einer Kondensorlinse, einer zu untersuchenden Probe, einer Objektivlinse, einem polychromatischen Polarisationszustandsanalysator und einem Farbbildsensor. Der polychromatische Polarisationszustandsgenerator wird durch den linearen Polarisator mit der Orientierung ψ und einen Quarzkristall mit Z-Schnitt gebildet, dessen optische Achse senkrecht zur Fensteroberfläche steht. Der polychromatische Polarisationszustandsanalysator besteht aus einem weiteren Quarzkristall mit Z-Schnitt und einem linearen Analysator mit der Ausrichtung ψ + 90°.

Schematische Darstellung eines polychromatischen Polarisationsmikroskops (polychromatisches Polscope).

Das polychromatische Polskop funktioniert auf folgende Weise. Das Spektrum des von der Lichtquelle abgestrahlten Strahls wird durch einen Bandpassfilter geformt. Der Filter kann an einer beliebigen Stelle im Lichtstrahlengang platziert werden. Anstelle der breitbandigen Lichtquelle können auch mehrere monochromatische Lichtquellen, beispielsweise Laser, verwendet werden. In diesem Fall wird der Bandpassfilter nicht benötigt. Der Filter ist auch nicht erforderlich, wenn das Spektrum des Strahls durch die spektrale Empfindlichkeit des Detektors wirksam eingeschränkt wird. Beispielsweise wird das Strahlungsspektrum der Sonne oder einer Glühbirne durch die Empfindlichkeit des menschlichen Auges effektiv auf etwa 400 nm bis etwa 700 nm beschränkt. Der Polarisator erzeugt einen linear polarisierten Strahl mit einer Polarisationsorientierung bei ψ. Dann dreht der erste Z-geschnittene Quarzkristall die Strahlpolarisationsebene um einen Winkel ϕ, der von der Wellenlänge λ abhängt. Somit wird die Ausrichtung der elektrischen Vektoren nach dem polychromatischen Polarisationszustandsgenerator spektral gestreut.

Prinzipiell können anstelle von Quarz auch andere optisch aktive Medien eingesetzt werden, um die erforderliche spektrale Polarisationsverteilung zu erzeugen. In allen gut nachgewiesenen Fällen optischer Aktivität ist die Kristall- oder Molekülstruktur von der Art, dass sie in zwei enantiomorphen Formen existieren kann, also Formen, die als Objekt und Spiegelbild miteinander verwandt sind, sich aber in keiner anderen unterscheiden Weg. In einer Form sind die Spiralen für eine bestimmte Richtung rechtsdrehend und in der anderen linksdrehend und ihre spezifischen Drehungen sind numerisch gleich, haben aber entgegengesetzte Vorzeichen. In Kristallen ist das Ausmaß der Lichtdrehung für eine bestimmte Wellenlänge für eine Platte mit einer Dicke von einem Millimeter die spezifische Drehung und ist entweder rechtsdrehend (rechtsdrehend) oder linksdrehend (linksdrehend), wenn man in Richtung der Lichtquelle blickt. Bei Flüssigkeiten ist es üblich, die spezifische Drehung in einer 10 cm langen Säule zu messen. Listen von Mineralien sowie anorganischen und organischen Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie optisch aktiv sind, wurden an vielen Stellen tabellarisch aufgeführt2,7.

Lassen Sie uns die Polarisationstransformation durch den polychromatischen Polarisationszustandsgenerator detaillierter beschreiben. Der Polarisator erzeugt einen linear polarisierten Strahl mit der Ausrichtung ψ. Anschließend durchläuft der Strahl den optisch aktiven Polarisationsrotator, der seine Polarisation um den Winkel ϕ dreht, ohne Elliptizität einzuführen13:

Dabei ist t die Dicke des Polarisationsrotators, λ die Wellenlänge und nL und nR die Brechungsindizes der linken bzw. rechten Zirkularpolarisation. Wenn nL > nR, dann ist der Polarisationsrotator d-rotatorisch, und wenn nR > nL, dann ist der Polarisationsrotator l-rotatorisch.

Im ausgewählten Spektralbereich entsprechen die minimalen und maximalen Polarisationsdrehwinkel ϕmin und ϕmax den längsten bzw. kürzesten Wellenlängen λmax und λmin:

Der Unterschied zwischen maximaler und minimaler Polarisationsdrehung beträgt 90°. In vielen Fällen ist die spektrale Streuung der zirkulären Doppelbrechung nL – nR gering und wir können annähernd davon ausgehen, dass sie nicht von der Wellenlänge abhängt. Dann kann die Dicke t des Polarisationsdrehers mithilfe der folgenden Formel ermittelt werden:

Nachdem wir (3) in Gleichung (1) eingesetzt und die erste Gleichung (2) berücksichtigt haben, erhalten wir die spektrale Abhängigkeit der Ausrichtung der Polarisationsebene des Beleuchtungsstrahls:

Es ist zweckmäßig, die Ausrichtung des Polarisators ψ = −ϕmin zu wählen. Dann vereinfacht sich Gleichung (4):

Insbesondere für das sichtbare Spektrum von 440 nm bis 660 nm haben wir die folgende spektrale Abhängigkeit der Ausrichtung der Polarisationsebene:

wobei die Wellenlänge λ in Nanometern angegeben ist.

Wie man sehen kann, verläuft die Polarisationsebene der roten Spektralkomponente (λ = 660 nm) parallel zur Anfangsachse (ϕ = 0°). Die Polarisationsebenen der Komponenten Orange (λ = 609 nm), Gelb (λ = 566 nm), Grün (λ = 528 nm), Cyan (λ = 495 nm) und Blau (λ = 466 nm) sind in einem Winkel von 15° ausgerichtet , 30°, 45°, 60° und 75° zur Anfangsachse entsprechend.

Der zweite Quarzkristall mit Z-Schnitt führt die inverse Polarisationsdrehung und die inverse spektrale Dispersion ein. Somit werden alle elektrischen Vektoren des Strahls auf ψ ausgerichtet. Der unter ψ + 90° ausgerichtete Analysator löscht den Strahl. Die in Abb. 1 gezeigte optische Konfiguration fungiert als gekreuzter linearer Polarisator und Analysator mit der Hauptebenenorientierung ϕ(λ) (siehe Gleichung (5)).

Die Intensität des Lichts I(λ), das von einer doppelbrechenden Probe zwischen gekreuztem Linearpolarisator und Analysator übertragen wird, wird durch die Formel beschrieben (siehe z. B. 14):

Dabei ist I0 die Intensität des Strahls nach dem Polarisator, φ und Δ die Orientierung der langsamen Achse und die Verzögerung (in nm) der Probe. Der Einfachheit halber gehen wir davon aus, dass der Extinktionsfaktor15,16 hoch genug ist und berücksichtigen daher die Depolarisation und das Streulicht nicht.

Eine Spektralkomponente mit der Wellenlänge λext wird ausgelöscht (I(λext) = 0), wenn φ = ϕ(λ) oder Δ = mλ, wobei m eine ganze Zahl ist (m = 0, 1, 2…). Wenn die Probenverzögerung kleiner als die Mindestwellenlänge im verwendeten Spektralband ist (Δ < λmin), hängt die ausgelöschte Wellenlänge nur von der Ausrichtung der langsamen Achse der Probe ab:

Wie man sieht, ist λext = λmax, wenn die langsame Achse parallel zur Anfangsachse ist (φ = 0°), und wenn φ = 90°, dann ist λext = λ min. Nehmen wir an, dass die langsame Achse der zu untersuchenden doppelbrechenden Probe in einem Winkel von 30° ausgerichtet ist. Dann ist λext = 566 nm. Die langsame Achse verläuft parallel zum elektrischen Vektor der gelben Polarisationskomponente und ist in einem Winkel von 45° zum elektrischen Vektor der blauen Komponente ausgerichtet. In diesem Fall passiert die gelbe Komponente die Probe ohne Polarisationsänderung und die Elliptizität der blauen Komponente nimmt zu. Der Analysator löscht die gelbe Farbe und die Probe erscheint blau. Bei einer Drehung der Probe um 45° ergibt sich φ = 75° und λext = 466 nm. Die Verzögerung der Probe erhöht die Elliptizität der gelben Komponente und hat keinen Einfluss auf den blauen elektrischen Vektor. Der Analysator entfernt die blaue Farbe und die Probe erscheint gelb. Der leere Hintergrundbereich hat keinen Einfluss auf die Elliptizität des Strahls und erscheint daher dunkel. Die Bildhelligkeit spiegelt den Grad der Verzögerung wider und die Bildfarbe zeigt die Ausrichtung der langsamen Achse. Wenn die Probenverzögerung groß ist (Δ ≥ λmin), hängt die ausgelöschte Wellenlänge sowohl von der Ausrichtung der langsamen Achse als auch von der Verzögerung ab. Das Farbbild wird komplizierter.

Im Fall der klassischen Newton-Interferenz (ϕ(λ) = 0°) erfolgt die spektrale Extinktion bei φ = 0° für alle Wellenlängen gleichzeitig. Bei dieser Ausrichtung ist die Probe unabhängig von ihrer Verzögerung dunkel und weist keine Färbung auf. Der Bildkontrast verschwindet. Die Intensität ist maximal, wenn die langsame Achse auf 45° ausgerichtet ist. Die erste ausgelöschte Wellenlänge tritt bei λ min auf. Die Farbe wird nur durch die Verzögerung der Probe bestimmt und hängt nicht von der Orientierung der langsamen Achse ab.

Viele Variationen des polychromatischen Polscope-Designs sind möglich und einige wurden bereits implementiert. Es kann im Durchlicht oder Auflicht verwendet werden. Im letzteren Fall trennt ein Halbspiegel die beleuchteten und reflektierten Strahlen. Der polychromatische Polarisationszustandsgenerator und -analysator kann sowohl im Durchlicht- als auch im Reflexionslichtschema in umgekehrter Reihenfolge angeordnet werden.

Die Diatomee Arachnoidiscus ist ein hervorragendes Exemplar, um die Vorteile des polychromatischen Polskops zu demonstrieren. Es hat eine verkieselte Zellwand, die eine radialsymmetrische, pillenschachtelartige Hülle (Frustule) bildet, die aus überlappenden Hälften besteht, die komplizierte und zarte Muster enthalten. Manchmal wird es „ein Rad aus Glas“ genannt. Die Diatomee Arachnoidiscus verdient die Bezeichnung „lebende photonische Kristalle“ und wurde eingesetzt, um eine subdiffraktive Fokussierung mit einer besseren Begrenzung des Lichtstrahls als bei anderen Fernfeld-Superfokussierungsansätzen zu ermöglichen17. Die Doppelbrechung der Arachnoidiscus-Struktur ist sehr gering, mit Ausnahme der zentralen radialen Filamente, die eine leicht erhöhte Verzögerung aufweisen. Nach unserer vorherigen Messung18 beträgt die Verzögerung der zentralen Filamente etwa 5 nm.

Drei Farbbilder der Kieselalge Arachnoidiscus wurden mit verschiedenen polarisierten Lichttechniken aufgenommen (siehe Abb. 2). Das linke Bild (Abb. 2a) wurde mit gekreuztem Polarisator und Analysator aufgenommen. Die zentralen radialen Filamente sind in diagonaler Richtung etwas heller. Vertikale und horizontale Filamente sind dunkel.

Bilder einer Kieselalge Arachnoidiscus.

Alle Bilder wurden in Weißlicht aufgenommen. Die Bildgröße beträgt 190 μm × 190 μm. Die maximale Verzögerung beträgt 5 nm. Das linke Foto (a) zeigt einen Fall mit gekreuztem Linearpolarisator und Analysator. Das mittlere Bild (b) zeigt einen Fall mit in den Strahlengang eingefügter Vollwellenplatte. Das rechte Bild (c) zeigt ein polychromatisches Polarisationsbild, dessen Helligkeit der Verzögerung entspricht und dessen Farbton die Ausrichtung der Hauptachse (doppelbrechend) darstellt.

Wir können die Newton-Farben auch verschieben, indem wir eine Vollwellenplatte (Verzögerung ~550 nm) hinzufügen, die auch als „empfindliche“ oder „rote“ Wellenplatte19 bezeichnet wird. Das mittlere Bild (Abb. 2b) zeigt das Ergebnis mit gekreuztem Polarisator und Analysator und hinzugefügter Vollwellenplatte. Das gesamte Bild ist violett mit einer kaum sichtbaren Farbtonänderung in den zentralen diagonalen Filamenten.

Das rechte Bild (Abb. 2c) wurde mit einem polychromatischen Polscope aufgenommen. Es zeigt das Diatomeenbild nach Hintergrundsubtraktion. Die Helligkeit entspricht der Verzögerung und der Farbton repräsentiert die Ausrichtung der langsamen Achse. Die Farben bestätigen, dass die doppelbrechende Struktur der Kieselalge radial ausgerichtete Hauptachsen aufweist.

Die polychromatische Lichtpolarisationstechnik ermöglicht es, ein farbiges Polarisationsbild direkt zu sehen und das Bild sofort und in Echtzeit aufzunehmen. Dadurch ist es möglich, die höchste zeitliche Auflösung zu erreichen. Wie gezeigt, liefert das polychromatische Polskop scharfe Bilder sich schnell bewegender, schwach doppelbrechender Strukturen und macht schnelle Prozesse sichtbar, die mit Doppelbrechungsänderungen einhergehen. In Kombination mit einer Pulslichtquelle soll das neue Mikroskop die Visualisierung der Entstehung von Nervenimpulsen, der Stoßwellenausbreitung etc. ermöglichen.

Wir haben die polychromatische Polarisationstechnik erfolgreich zur Abbildung verschiedener Arten sich schnell bewegender Rädertierchen eingesetzt. Bdelloid-Rädertierchen sind mikroskopisch kleine wirbellose Süßwassertiere, die vor allem für ihre Fähigkeit bekannt sind, in jedem Lebensstadium häufige Zyklen der Austrocknung und Rehydrierung zu durchlaufen, für ihre langfristige Asexualität, die sich in Abwesenheit von Männchen und Meiose manifestiert, und für die Fähigkeit, fremdes genetisches Material einzufangen in einem Ausmaß, das bei Metazoen beispiellos ist20. Ein Livebild des Riesenradifers Adineta vaga, sichtbar mit einem polychromatischen Polarisationslichtmikroskop bei 20-facher Vergrößerung, ist in Abb. 3 dargestellt. Dieses Bild eines erwachsenen Weibchens betont charakteristische Strukturen wie den Rachen mit einer Mastax, die aus harten Kiefern (Trophi) besteht. eine Reihe von Ring- und Längsmuskeln, beidseitige Eierstöcke mit Eizellenkernen und die sich parthenogenetisch entwickelnde Eizelle.

Polarisiertes polychromatisches Bild des Rädertierchens Adineta vaga.

Die Bildgröße beträgt 283 μm × 283 μm.

Polarisierte Lichtmikroskopie wird seit langem für Malariastudien eingesetzt21,22,23. Es ermöglicht die Sicht auf das Malariapigment Hämozoin, ein kristallines Produkt der Hämoglobinverdauung durch die Parasiten. Durch die direkte Abbildung von Hämozoin erfordert die Polarisationsmikroskopie keine exogenen Kontrastmittel zur Malariadiagnose. Es kann einfach für die Analyse frischer Proben verwendet werden. Wir untersuchten mit Plasmodium yoelii infizierte Mäuse, sowohl fixierte als auch unfixierte. Das polychromatische Bild eines Blutausstrichs ist in Abb. 4 dargestellt. Farbige, brillant doppelbrechende Körnchen des Hämozoins sind deutlich sichtbar. Die kleinen Hämozoinkörnchen sind von großen bräunlich-roten Blutkörperchen umgeben. In einer frischen Probe rotieren die Hämozoinkörnchen frei und ändern die Farbe entsprechend ihrer Ausrichtung der optischen Achse. Die Hämozoine erscheinen als ansprechende Weihnachtslichter, die in wechselnden Farben blinken.

Polarisiertes polychromatisches Bild eines Blutausstrichs einer mit Malaria infizierten Maus.

Die Bildgröße beträgt 26 μm x 26 μm.

Das polychromatische Polskop ermöglicht die Visualisierung von Kollagen, ohne dass spezielle Färbungen oder Mikroskopie der zweiten Harmonischen Generation erforderlich sind. Kollagen macht fast ein Viertel des Proteins im menschlichen Körper aus. Das Verständnis, wie Kollagen organisiert ist, kann zu einem Verständnis darüber führen, wie gesundes Gewebe in Bereichen wiederhergestellt werden kann, die von Verbrennungen, Narben, Krankheiten usw. betroffen sind. Die polychromatische Technik kann nützlich sein, um den Grad der Ansammlung in atherosklerotischen Plaques zu quantifizieren und die Kollagenorganisation zu identifizieren Fibrose und Messung des Fortschritts von synthetischem Gewebe im Tissue Engineering. Kollagen wird mit Standard-Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Schnitten (H&E) mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen.

Abbildung 5 zeigt ein Beispiel für ein polarisationspolychromatisches Bild einer histologischen Probe mit dichten Tumoren und einer Invasion in das kollagene Stroma um sie herum. Die Probe ist von H&E gefärbt. Im Bild umgibt das kollagene Stroma variabler Farbe die Nester rosafarbener Krebszellen. Die Helligkeit des Stromas spiegelt den Grad der Retardierung der Kollagenfasern wider und die Farbe zeigt ihre langsame Achsenorientierung.

Polarisiertes polychromatisches Bild doppelbrechender Kollagenfasern in HE-gefärbtem Brustkrebsgewebe.

Die Bildgröße beträgt 660 μm × 867 μm.

Polarisierte Lichtmikroskopie wurde in Gehirnstudien häufig eingesetzt, beispielsweise zur Untersuchung der Wandstrukturintegrität von Hirnarterien24, der Wege der Faserbahnen der weißen Substanz im menschlichen Gehirn25,26,27,28,29, der Wandstärke in sackförmigen Hirnaneurysmen30, ungefärbte Cochlea-Querschnitte der Maus31 usw. Wir haben ein neues polychromatisches Polskop zur Abbildung des Colliculus superior im Gehirnschnitt der Maus getestet32. Die Probe wurde weder chemisch behandelt noch gefärbt. Abbildung 6 zeigt eine koronale Ansicht eines 20 μm dicken Abschnitts des Gehirns, der entlang einer vertikalen Achse geschnitten wurde, um ihn in Vorder- und Rückseite zu unterteilen. Nervenzellen erscheinen in den echten Farben, die die Orientierung der Moleküle verraten. Der mediale Kern des Trapezkörpers ist deutlich sichtbar.

Polarisiertes polychromatisches Bild eines Mausgehirnschnitts.

Die Bildgröße beträgt 2,9 mm × 2,1 mm.

Natürlich ist der Einsatz des neuen polychromatischen Polskops nicht auf biomedizinische Anwendungen beschränkt. Abbildung 7 zeigt ein Echtfarbbild der Europakarte, die durch eine doppelbrechende selbstorganisierte Nanostruktur erstellt wird. Die Probe wurde mit der von Prof. entwickelten Laser-Nanostrukturierungstechnik hergestellt. Peter Kazansky-Gruppe vom Optoelectronics Research Center an der Southampton University33,34,35,36. Die Europakarte wurde mit dem Femtosekundenlaser im Inneren des Quarzglassubstrats erstellt, auf dem Gebiete verschiedener Länder mit unterschiedlicher Polarisation des Lasers eingeschrieben waren.

Polarisiertes polychromatisches Bild einer mit einem Femtosekundenlaser geschriebenen Karte Europas in Quarzglas.

Die Bildgröße beträgt 196 × 167 μm.

Die geschriebenen Nanogitter manifestieren die Form der Doppelbrechung. Im Gegensatz zur intrinsischen Doppelbrechung, die auf die Anisotropie orientierter Moleküle zurückzuführen ist, wird die Formdoppelbrechung durch die Ausrichtung submikroskopischer Anordnungen dünner zylindrischer Stäbe oder planparalleler Platten verursacht, deren Brechungsindex sich vom umgebenden Medium unterscheidet37,38. Die Plattenanordnung verhält sich immer wie ein negativer einachsiger Kristall, dessen optische Achse senkrecht zur Plattenebene verläuft. Die Stabanordnung verhält sich wie ein positiver einachsiger Kristall, dessen optische Achse parallel zu den Achsen der Stäbe verläuft. Zum Vergleich: Quarzkristall ist ein positiver einachsiger Kristall. Das Vorzeichen der Doppelbrechung gibt an, ob die Form der Strukturform eher der eines Stabes oder einer Platte ähnelt. Es wurde gezeigt, dass Nanogitter immer wie ein negativer einachsiger Kristall wirken39.

Zwei Parameter der Doppelbrechung, Verzögerung und Orientierung der langsamen Achse, können während des Schreibvorgangs unabhängig voneinander gesteuert werden. Die langsame Achse wird durch die Strahlpolarisation definiert. Die Verzögerung ist eine Funktion der Laserfluenz. Die Verzögerung hängt auch von der Wellenlänge, der Pulsdauer und der Anzahl der Laserpulse ab. Die Verzögerung kann mit einer Genauigkeit von etwa 10 nm gesteuert werden, während der Winkel der langsamen Achse mit einer Genauigkeit von wenigen Grad definiert werden kann33,34,35,36. Doppelbrechende Nanogitter können Temperaturen von 1000 °C standhalten und sind daher ideal für die Archivierung großer Mengen wichtiger Informationen. Die Fähigkeit, mehrere Informationsschichten über Nanogitter aufzuzeichnen und zu lesen, wurde ebenfalls demonstriert36.

Wir haben das neue polychromatische Polskop entwickelt, das natürliche Farbbilder doppelbrechender Strukturen mit einer Verzögerung <400 nm erzeugt. Doppelbrechende Bilder in der echten Farbe werden sofort erfasst. Der Kontrast wird bei jeder Probenausrichtung erzeugt. Das polychromatische Polskop kann zur Untersuchung von Kollagenfasern in Krebsgewebe, kristallinem Hämozoin in mit Malaria infizierten Zellen, der Gehirnstruktur, Flimmerhärchen in Stentoren, Mastax, Flimmerhärchen und Muskelfasern in Rädertierchen, Skelettstäben in Arbacia punctulata, Muskelfasern und Otholithen in Zebrafischen eingesetzt werden. Nierensteine, Amyloiddoppelbrechung usw.

Diatom Arachnoidiscus Ehrenbergi-Objektträger (Turtox-Objektträgerserie Nr. B1.144 „Diatoms“) wurde von General Biological Supply House, Inc. (Chicago, IL, USA) hergestellt. Wir verwendeten ein aufrechtes Lichtmikroskop Olympus BX61 (Olympus America, Center Valley, PA, USA), ausgestattet mit der Objektivlinse UPlanFl 40 x/0,75P und der 100-W-Halogenlampe U-LH100-3-5. Alle Bilder wurden in Weißlicht ohne Filter aufgenommen. Das mittlere Bild (Abb. 1b) wurde mit der Hinzufügung einer roten Vollwellenplatte erster Ordnung Olympus U-TP530 aufgenommen. Die Bilder wurden mit der Consumer-Spiegelreflexkamera Nikon D40 x (Nikon, Melville, NY, USA) aufgenommen. Die Bildgröße beträgt 190 μm × 190 μm.

Ein lebendes Exemplar des Riesenradifers Adineta vaga wurde von Irina Arkhipova vom Marine Biological Laboratory (Woods Hole, MA, USA) zur Verfügung gestellt. Wir verwendeten ein aufrechtes Lichtmikroskop Olympus BX61 (Olympus America, Center Valley, PA, USA), ausgestattet mit der Objektivlinse UPlanFl 20 x/0,50 P und der 100-W-Halogenlampe U-LH100-3-5. Das Bild wurde in weißem Licht ohne Filter aufgenommen. Die Bilder wurden mit der Hamamatsu ORCA-3CCD-Kamera C7780-20 (Hamamatsu Photonics, Japan) aufgenommen. Die Belichtungszeit betrug 5 ms. Die Bildgröße beträgt 283 μm x 283 μm.

Ein Objektträger mit Blutausstrichen einer mit Plasmodium yoelii infizierten Maus wurde von Photini Sinnis vom Johns Hopkins Malaria Research Institute (Baltimore, MD, USA) zur Verfügung gestellt. Wir verwendeten ein inverses Lichtmikroskop Olympus IX81 (Olympus America, Center Valley, PA, USA), ausgestattet mit der Objektivlinse UPlanFl N 100x/1,30 Oil P, einem 2-fach-Zoomobjektiv und einer 100-W-Halogenlampe U-LH100-3-5. Das Bild wurde in weißem Licht ohne Filter aufgenommen. Die Bilder wurden mit der Olympus CCD-Kamera DP73 aufgenommen. Die Bildgröße beträgt 26 μm x 26 μm.

Das H&E-gefärbte Brustkrebsgewebe mit doppelbrechenden Kollagenfasern wurde von Richard Levenson vom UC Davis Medical Center (Sacramento, CA, USA) bereitgestellt. Wir verwendeten ein inverses Lichtmikroskop Olympus IX81 (Olympus America, Center Valley, PA, USA), ausgestattet mit der Objektivlinse UPlanFL N 10 x/0,30 P und der 100-W-Halogenlampe U-LH100-3-5. Das Bild wurde in weißem Licht ohne Filter aufgenommen. Die Bilder wurden mit der Hamamatsu ORCA-3CCD-Kamera C7780-20 (Hamamatsu Photonics, Japan) aufgenommen. Die Bildgröße beträgt 660 μm x 867 μm.

Ein Objektträger mit einem 20 μm dicken Schnitt des koronalen Hirnstamms einer Maus wurde von Timothy Balmer vom Georgia State University Neuroscience Institute (Atlanta, GA, USA) zur Verfügung gestellt. Wir verwendeten ein inverses Lichtmikroskop Olympus IX81 (Olympus America, Center Valley, PA, USA), ausgestattet mit einem Objektivobjektiv UPlanFL 4 x/0,13, einem Zoomobjektiv 0,5 x und einer 100-W-Halogenlampe U-LH100-3-5. Das Bild wurde in weißem Licht ohne Filter aufgenommen. Die Bilder wurden mit der Farb-CCD-Kamera DP73 von Olympus aufgenommen. Die Bildgröße beträgt 2,9 mm x 2,1 mm.

Ein Objektträger aus Quarzglas mit der Europakarte wurde von Mindaugas Gecevicius und Martynas Beresna (Universität Southampton, Großbritannien) zur Verfügung gestellt. Wir verwendeten ein Umkehrlichtmikroskop Olympus IX81 (Olympus America, Center Valley, PA, USA), ausgestattet mit der Objektivlinse UPlanFL 20 x/0,50 P und der 100-W-Halogenlampe U-LH100-3-5. Das Bild wurde in weißem Licht ohne Filter aufgenommen. Die Bilder wurden mit der Farb-CCD-Kamera DP73 von Olympus aufgenommen. Die Bildgröße beträgt 196 × 167 μm.

Zitierweise für diesen Artikel: Shribak, M. Polychromatisches Polarisationsmikroskop: Farben in eine farblose Welt bringen. Wissenschaft. Rep. 5, 17340; doi: 10.1038/srep17340 (2015).

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Referenzen herunterladen

Der Autor dankt Shinya Inoué vom Marine Biological Laboratory (Woods Hole, MA) für nützliche Diskussionen und Anregungen. Wir danken den folgenden Kollegen für die Bereitstellung von Proben: James LaFountain von der State University of New York (Buffalo, NY) für Kieselalgen, Irina Arkhipova vom Marine Biological Laboratory (Woods Hole, MA) für Rädertiere, Richard Levenson von UC Davis Medical Center (Sacramento, CA) für Brustkrebsgewebe, Photini Sinnis vom Johns Hopkins Malaria Research Institute (Baltimore, MD) für Malariaproben, Timothy Balmer vom Georgia State University Neuroscience Institute (Atlanta, GA, USA) für Mäusehirnproben, Mindaugas Gecevicius und Martynas Beresna (University of Southampton, UK) für die nanostrukturierte Europakarte, geschrieben in Quarzglas. Diese Veröffentlichung wurde durch die Fördernummer R01-GM101701 des National Institute of General Medical Sciences, National Institutes of Health, ermöglicht. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung des Autors und gibt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des National Institute of General Medical Sciences oder der National Institutes of Health wieder.

Marine Biological Laboratory, 7 MBL St, Woods Hole, 02543, MA, USA

Michael Shribak

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Nachdrucke und Genehmigungen

Shribak, M. Polychromatisches Polarisationsmikroskop: Farben in eine farblose Welt bringen. Sci Rep 5, 17340 (2015). https://doi.org/10.1038/srep17340

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Eingegangen: 13. Juli 2015

Angenommen: 28. Oktober 2015

Veröffentlicht: 27. November 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep17340

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