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Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 10808 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Dystrophische Muskeln sind durch Nekrose-/Regenerationszyklen, Entzündungen und fibroadipogene Entwicklung gekennzeichnet. Herkömmliche histologische Färbungen liefern wesentliche topografische Daten dieser Umgestaltung, können jedoch auf die Unterscheidung eng verwandter pathophysiologischer Kontexte beschränkt sein. Sie erwähnen nicht die Veränderungen der Mikroarchitektur, die mit der Art und räumlichen Verteilung der Gewebekompartimentkomponenten zusammenhängen. Wir untersuchten, ob die markierungsfreie Gewebeautofluoreszenz, die durch tiefe Ultraviolettstrahlung (DUV) von Synchrotron sichtbar gemacht wird, als zusätzliches Instrument zur Überwachung des dystrophischen Muskelumbaus dienen könnte. Mithilfe von Weitfeldmikroskopie mit spezifischen Emissionsfluoreszenzfiltern und Mikrospektroskopie mit hoher spektraler Auflösung analysierten wir Proben von gesunden Hunden und zwei Gruppen dystrophischer Hunde: naive (stark betroffene) und MuStem-zelltransplantierte (klinisch stabilisierte) Tiere. Multivariate statistische Analysen und maschinelle Lernansätze zeigten, dass die vom Musculus biceps femoris bei 420–480 nm emittierte Autofluoreszenz effektiv zwischen gesunden, dystrophischen und transplantierten Hundeproben unterscheidet. Die Mikrospektroskopie zeigte, dass dystrophische Hundemuskeln aufgrund der Kollagenvernetzung bzw. NADH eine höhere bzw. geringere Autofluoreszenz aufweisen als die von gesunden und transplantierten Hunden, was Biomarker zur Bewertung der Auswirkungen einer Zelltransplantation definiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass DUV-Strahlung eine empfindliche, markierungsfreie Methode zur Beurteilung des histopathologischen Status dystrophischer Muskeln anhand kleiner Gewebemengen ist, mit potenziellen Anwendungen in der regenerativen Medizin.

Muskeldystrophien (MD) sind eine genetisch heterogene Gruppe von mehr als 50 neuromuskulären Erkrankungen der Skelettmuskulatur. Allen gemeinsam ist die fortschreitende Muskelschwäche und der Muskelschwund, sie unterscheiden sich jedoch im klinischen Erscheinungsbild und in der Schwere der Symptome1,2. Sie sind durch eine lokale oder generalisierte Degeneration der Muskelfasern gekennzeichnet1. Die Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist die häufigste MD und betrifft 1 von 3500–5500 männlichen Neugeborenen3. Diese X-chromosomal rezessiv vererbte tödliche Muskelerkrankung wird durch Mutationen im Dystrophin-Gen verursacht, die zu einem Mangel an einem funktionellen Protein führen, das für die Aufrechterhaltung der Muskelfaserintegrität unerlässlich ist4. Dies führt zu einer tiefgreifenden Störung der Gewebehomöostase, die durch Veränderungen in der Faserzusammensetzung, erhöhte Variation der Fasergröße, Zentronukleation, Entzündung und Ersatz von Muskelfasern durch Faser- und Fettgewebe gekennzeichnet ist5,6.

Die histologische Charakterisierung der ausgedehnten Veränderungen im dystrophischen Skelettmuskel liefert wichtige Informationen zur Pathophysiologie der Krankheit und ist ein wichtiges Instrument zur Bewertung der Auswirkungen neuartiger Therapiestrategien7. Standardmäßig quantifizierbare Gewebeparameter, einschließlich der Anzahl der Fasern, des Feret-Durchmessers, der Fasertypzusammensetzung, des Prozentsatzes zentronukleärer Fasern und des Anteils an Fibrose und Adipositas, werden in Skelettmuskelquerschnitten gemessen, die mit klassischen topografischen Färbetechniken wie Hämatoxylin-Eosin gefärbt wurden -Safran (HES), Picrosirius-Rot und Gomori-Trichrom und/oder spezifische Immunmarkierung8. Allerdings kann die Bewertung der Umgestaltung des Bindegewebes manchmal schwieriger sein: Endomysiale Fibrose kann schwierig genau zu quantifizieren sein, wenn die eingenommene Oberfläche streng berücksichtigt wird, ohne die Kollagenanordnung innerhalb der extrazellulären Matrix zu integrieren, die sich als entscheidend für die mechanische Funktion erwiesen hat9. Daher ist es möglicherweise kein ausreichend diskriminierendes Kriterium für eine genaue Beurteilung des Krankheitsverlaufs. Ebenso fehlen Methoden zur Bewertung der Wirksamkeit therapeutischer Strategien10. Aktuelle Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die Organisation des Kollagennetzwerks und insbesondere die Kollagenvernetzung einen potenziellen Biomarker für DMD darstellen11,12,13. Auf funktioneller Ebene spielt die Kollagenvernetzung eine entscheidende Rolle bei der Muskelsteifheit14,15 und wurde mithilfe von Polarisationslichtmikroskopie12 und Bildgebung der zweiten Harmonischen (SHG)12 in mit Herovici13 und Picrosirius-Rot gefärbten Gewebeschnitten analysiert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die SHG-Bildgebung von gereinigtem Gewebe ein leistungsstarker, markierungsfreier Ansatz für die 3D-Charakterisierung von Herzfibrose bei DMD ist16. Darüber hinaus kann die Autofluoreszenz von Biomakromolekülen als Reaktion auf die Synchrotron-Mikroskopie im tiefen Ultraviolett (DUV) einen nützlichen Marker für die ultrastrukturelle Charakterisierung verschiedener tierischer Gewebe17,18,19 und für die Überwachung der Muskelfasertypisierung und des Stoffwechselstatus20,21 darstellen.

In der vorliegenden Studie haben wir mithilfe von Spektralsignalen, die mit Synchrotron-DUV-Fluoreszenzstrahlung erzeugt wurden, untersucht, ob dystrophische Muskeln eine eindeutige Gewebesignatur aufweisen, die ohne chemische Färbung und ohne gezieltes Anvisieren eines Gewebekompartiments erkannt werden kann. Skelettmuskelproben von Hunden mit Golden-Retriever-Muskeldystrophie (GRMD), einem klinisch relevanten Tiermodell für DMD22,23, wurden Synchrotron-DUV-Strahlung ausgesetzt und die resultierende Autofluoreszenz mit der von gesunden Golden-Retriever- (GR) und GRMD-Hunden verglichen, die sich einer erwachsenen Erkrankung unterzogen hatten Stammzelltransplantation (MuStem-Zellen) (GRMDT), eine mögliche Therapie für DMD10,24,25,26,27. DUV-Autofluoreszenz, die durch Kollagenvernetzung, Tyrosin, Elastin, Tryptophan und Nicotinamidadenindinukleotiddehydrogenase (NADH) erzeugt wird, kann mithilfe selektiver Emissionsfilter von 300–540 nm mit schmalem Bandpass (Bereich 40–60 nm) und hoher spektraler Auflösung identifiziert werden (Schritt von 0,5 nm) unter Verwendung von Weitfeld-DUV-Mikroskopie bzw. DUV-Mikrospektroskopie18,19,20,21,28. Mit manueller Bildanmerkung, multivariater statistischer Analyse ohne Vorverarbeitung von Synchrotronbildern und maschinellem Lernen haben wir herausgefunden, dass die drei verschiedenen Hundegruppen anhand der unterschiedlichen Intensität der Autofluoreszenzemission im Muskelmaterial unterschieden werden konnten, was hauptsächlich auf Unterschiede in der Kollagenkreuzung zurückzuführen ist. Verknüpfung, gemessen durch Weitfeld-DUV-Mikroskopie. Wichtig ist, dass hier maschinelles Lernen anhand von beschrifteten Beispielen angewendet wurde, um Strukturmuster zu finden, die für die automatische Klassifizierung geeignet sind, und dabei Rohbilddaten vollständig statt segmentierter Elemente als Kanten verarbeitet. Darüber hinaus ergab die DUV-Mikrospektroskopie zwei wesentliche Unterschiede in der Autofluoreszenz bei naiven GRMD-Hunden im Vergleich zu gesunden GR-Kontrollen und mit MuStem-Zellen behandelten GRMD-Hunden: einen signifikanten Anstieg der Autofluoreszenz im Bereich 305–480 im endomysialen Bindegewebe aufgrund der Kollagenvernetzung und eine Abnahme der Autofluoreszenz um 460 nm innerhalb der Muskelfasern aufgrund von NADH.

Unsere Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass die Analyse der Synchrotron-DUV-Strahlung eine Charakterisierung des Umbaus dystrophischer Muskeln mit hoher Unterscheidungskraft ermöglicht, wobei nur eine kleine Menge unmarkierten Gewebes verwendet wird. Sie zeigen, dass diese Technik, obwohl sie auf einen kleinen Muskelbereich angewendet wird, der hinsichtlich der Repräsentativität möglicherweise eine Grenze darstellt und eine spezielle Mikroskopieausrüstung erfordert, für die Bewertung der Wirksamkeit neuer Therapiestrategien und die Unterstützung der Patientenüberwachung im Kontext der regenerativen Medizin nützlich sein könnte.

Wir haben zuvor gezeigt, dass intraarterielle (IA) Injektionen von Wildtyp-MuStem-Zellen bei jungen GRMD-Hunden positive Auswirkungen auf den klinischen Status und die Gewebeorganisation haben10,25. In der vorliegenden Studie haben wir diese Effekte nach intravenöser (IV) Zellabgabe, einem chirurgischen Ansatz, der bei DMD-Patienten viel besser anwendbar ist, an Tieren im Alter von 2,8 und 4,4 Monaten reproduziert (Tabelle 1). Die Bewegungseinschränkung von GRMD-Hunden wurde mithilfe eines zusammengesetzten klinischen Scores auf der Grundlage von 17 Einzelparametern quantifiziert. Gesunden GR-Hunden wurde ein Wert von 100 % zugewiesen. Bei Einschluss des Protokolls hatten alle GRMD-Hunde einen gleichwertigen klinischen Wert zwischen 89,1 und 93,9 %, mit Ausnahme eines Hundes (Nr. 6) mit einem Wert von 79,8 % (Tabelle 2). Zu Beginn des Transplantationsprotokolls wiesen GRMD-Hunde einen klinischen Score zwischen 82,0 und 92,1 % auf, mit Ausnahme von zwei Hunden (#3 und #7) mit einem Score von 74,7 % und 75,1 %. Am Ende des Protokolls (d. h. 4,9–6,4 Monate nach der ersten Zelltransplantation) zeigten GRMD-Hunde im Vergleich zu 8–10 Monate alten gesunden GR-Hunden schwere klinische Beeinträchtigungen, die hauptsächlich durch Steifheit, abnormale Haltung und Unfähigkeit zum Laufen oder Springen gekennzeichnet waren . Die 4 GRMD-Hunde hatten unterschiedliche Werte zwischen 23,3 und 72,6 %. Im Gegenzug waren die für GRMDT-Hunde erzielten Ergebnisse viel homogener und lagen zwischen 75,1 und 87,0 %. Zwischen GRMD- und GRMDT-Hunden wurde ein signifikanter Unterschied in der Bewertung der Bewegungsbehinderung beobachtet (Mann-Whitney-Test, p = 0,029). Darüber hinaus wurde die Differenz zwischen diesem Endwert und dem klinischen Wert, der im Alter der Aufnahme erhalten wurde, berechnet, um den Krankheitsverlauf in den beiden dystrophischen Hundegruppen widerzuspiegeln. Während dieses Zeitraums zeigten alle GRMD-Hunde eine deutliche oder schwere Beeinträchtigung ihrer klinischen Ergebnisse (Medianwert = -30,9 %; Bereich: -51,8 bis -19,53 %), im Gegensatz zu den GRMDT-Hunden, bei denen die klinischen Ergebnisse viel konstanter waren (Medianwert = -4,1 %; Bereich: -11,0 bis + 1,4 %). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die intravenöse Verabreichung allogener MuStem-Zellen einen positiven klinischen Einfluss hat und zu einer Stabilisierung des klinischen Status führt, was mit unseren früheren Erkenntnissen nach einer IA-Transplantation übereinstimmt.

Um die histopathologischen Auswirkungen der intravenösen Verabreichung von MuStem-Zellen im GRMD-Hundemuskel zu untersuchen, führten wir eine standardmäßige topografische Färbung und Immunmarkierung gegen die Entwicklungsisoform der Myosin-Schwerkette (MyHCd) in Querschnitten von GR-, GRMD- und GRMDT-Hunden durch. Die Hämatoxylin-Eosin-Safran-Färbung (HES) zeigte, dass die Größe der einzelnen Muskelfasern von GRMD- und GRMDT-Hunden über ganze Muskelabschnitte hinweg heterogener war als bei gesunden GR-Hunden, eine Veränderung, die als Anisozytose bezeichnet wird (Abb. 1; erste Reihe). Ganze Muskelabschnitte von GRMD- und GRMDT-Hunden zeigten einige isolierte nekrotische Fasern, die bei GRMD-Hunden manchmal durch Mineralablagerungen ersetzt wurden. Während in gesunden GR-Hundemuskelabschnitten keine MyHCd+-Fasern beobachtet wurden, wurden in GRMD-Hundeabschnitten einige isolierte positive Fasern nachgewiesen (Abb. 1; zweite Reihe). Im Gegensatz dazu beobachteten wir in GRMDT-Hundemuskelschnitten Gruppen von MyHCd+-Fasern (Pfeil in Abb. 1; zweite Reihe, rechte Tafel), was auf eine nachhaltigere Muskelregeneration hinweist. Darüber hinaus wurden bei GRMD- und GRMDT-Hunden auch Ansammlungen kleiner Zellen (ca. 15–20 µm) mit reichlich eosinophilem Zytoplasma und großem Zellkern als positiv für MyHCd nachgewiesen und entsprachen Myoblasten, was auf Faserregenerationsherde hinweist (Abbildung S1, oberes Feld). . Ganze Querschnitte, die mit Picrosirius-Rot, das spezifisch für Kollagen ist, gefärbt wurden, zeigten, dass perimysiales und epimysiales Gewebe bei GRMD-Hunden im Vergleich zu GR-Hunden durch Fibrose verdickt war (Abb. 1; dritte Reihe). Zwischen GRMD- und GRMDT-Hunden wurden keine Unterschiede im kollagenpositiven Bereich im Verhältnis zur Gesamtschnittfläche beobachtet (Abbildung S1, unteres Feld). Schließlich zeigte die Histoenzymologie zum Nachweis der Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Dehydrogenase-Tetrazolium-Reduktase (NADH-TR)-Aktivität in Mitochondrien eine homogene Verteilung von mitochondrienreichen und mitochondrienarmen Fasern bei gesunden GR-Hunden (Abb. 1; untere Reihe). Diese Verteilung war bei GRMD- und GRMDT-Hunden deutlich verändert, mit einer gewissen Gruppierung der Fasertypen. Hinsichtlich der mitochondrialen Verteilung gab es keinen Unterschied zwischen den beiden Tiergruppen.

Repräsentative serielle histologische Schnitte vom Biceps femoris-Muskel eines Hundes. Querschnitte von gesunden (Golden Retriever; GR), dystrophischen (Golden Retriever Muskeldystrophie; GRMD) und mit Stammzellen behandelten dystrophischen GRMD (GRMDT) Hunden wurden mit Hämatoxylin-Eosin-Safran (HES) angefärbt; erste Reihe, Pfeilspitzen zeigen Mineralablagerungen in an GRMD-Hunde) und immunmarkiert für die Entwicklungsisoform der schweren Myosinkette (MyHCd; zweite Reihe, Pfeile zeigen Gruppen positiver Fasern im GRMDT-Hundemuskel an). Bindegewebe wurde durch spezifische Picrosirius-Rot-Färbung sichtbar gemacht (dritte Reihe). Die Schnitte wurden histoenzymologisch gefärbt, um die Aktivität der Nikotinamidadenindinukleotiddehydrogenase-Tetrazoliumreduktase (NADH-TR; untere Reihe) in Mitochondrien sichtbar zu machen. Die gleichen Beschriftungen (Pfeil, Pfeilspitze) wurden auf den vier histologischen Präparaten (obere und untere Tafel) verwendet, um die interessanten Merkmale hervorzuheben, die nach der seriellen Schnittführung der Gewebe erhalten bleiben. Maßstabsbalken: 100 µm.

Um diese Daten zu ergänzen, haben wir die Anzahl der neu gebildeten Fasern und die Bindegewebsfläche in ganzen Muskelabschnitten der drei Hundegruppen anhand der Fluoreszenzmarkierung für MyHCd bzw. WGA quantifiziert (Abb. 2a). Wir entdeckten 0,04 % ± 0,20 %, 8,63 % ± 5,18 % und 14,40 % ± 7,78 % MyHCd+-Fasern bei GR-, GRMD- und GRMDT-Hunden (Abb. 2b, oben). GRMDT-Hundemuskelproben zeigten einen höheren Anteil an MyHCd+-Fasern im Vergleich zu GRMD-Hundeproben (p < 0,001), was auf eine stärkere Muskelregeneration nach IV-Transplantation von MuStem-Zellen hinweist. Die Markierung mit Alexa 555-Weizenkeim-Agglutinin (WGA) zeigte, dass die von Bindegewebe eingenommene Fläche 14,26 % ± 5,20 %, 32,05 % ± 9,08 % und 33,16 % ± 3,74 % in Skelettmuskelproben von GR-, GRMD- und GRMDT-Hunden entsprach , jeweils. Bei GRMD-Hunden war dieser Bereich höher als bei GR-Hunden (p < 0,001; Abb. 2b, unten) und ähnelte dem bei GRMDT-Hunden festgestellten Bereich, was darauf hindeutet, dass die IV-Transplantation von MuStem-Zellen das Ausmaß der Endomysialfibrose in dystrophischen Muskeln nicht verändert. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die regenerative Aktivität dystrophischer Muskeln der primäre histopathologische Marker für die Wirkung der intravenösen Verabreichung von MuStem-Zellen ist.

Histomorphometrische Analyse des Bizeps femoris-Muskels eines Hundes. (a) Die regenerative Aktivität wurde durch Immunmarkierung für die Entwicklungsisoform der Myosin-Schwerkette (MyHCd, obere Reihe; rot) in Muskel-Kryoschnitten von gesunden (Golden Retriever; GR), dystrophischen (Golden Retriever-Muskeldystrophie; GRMD) und MuStem-Zellen bewertet -behandelte Hunde mit dystrophischer GRMD (GRMDT). Endomysiales Bindegewebe wurde mit Weizenkeimagglutinin (WGA, untere Reihe; Magenta) gefärbt. Zur Abgrenzung der Umrisse der Muskelfasern wurde eine Laminin-Immunmarkierung durchgeführt. (b) Die Anzahl der MyHCd+-Fasern und der Anteil des WGA+-gefärbten Gewebes wurden in allen drei Gruppen bestimmt. Maßstabsbalken: 200 µm. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Tukey-Mehrfachvergleichstest geschätzt. ** p < 0,0001; * p = 0,0046.

Die deutlichen Auswirkungen der intravenösen Verabreichung von MuStem-Zellen auf den allgemeinen klinischen Status von GRMD-Hunden stehen in erheblichem Kontrast zu den bescheidenen Auswirkungen, die auf histologischer Ebene beobachtet wurden. Wir haben daher den Nutzen einer anderen Bildgebungsmodalität untersucht, um festzustellen, ob die endogenen Fluoreszenzeigenschaften von Gewebe als Reaktion auf DUV-Strahlung als Signatur für erkrankte Muskeln dienen könnten. Wir haben DUV-Strahlung vom Synchrotron auf Skelettmuskelproben von jeder der drei Hundegruppen angewendet. Insbesondere untersuchten wir markierungsfreie Gewebeschnitte mithilfe der DUV-Weitfeldmikroskopie und Mikrospektroskopie und führten eine statistische Analyse von Fluoreszenzhistogrammen durch, um Eingaben für Algorithmen des maschinellen Lernens bzw. Hauptkomponentenanalysemethoden zu generieren (wie in Abb. 3 zusammengefasst). Unter Verwendung der ursprünglichen Rohpixelwerte wurden zunächst deskriptive globale Statistiken für Bilder der drei Hundegruppen (Abb. 3a) und entsprechende Filter berechnet. Mithilfe des resultierenden Datensatzes untersuchten wir die 4 Klassifizierungsfälle, die sich aus der Kombination von Paaren von Hundegruppen (GR vs. GRMD, GR vs. GRMDT, GRMD vs. GRMDT) und den 3 Hundegruppen (GR vs. GRMD vs. GRMDT) ergeben, um zunächst die zu identifizieren bestes Set an Attributen und die besten Algorithmen für maschinelles Lernen. Als nächstes wurde der beste Satz von Attributen auf optimierte Versionen der identifizierten besten Algorithmen für maschinelles Lernen angewendet (Abb. 3b). Dieser experimentelle Ansatz eignet sich gut für die Ziele der Entwicklung einer zerstörungsfreien, markierungsfreien Methode mit geringem Gewebeverbrauch zur Gewebeanalyse unter Verwendung einer Fluoreszenzanalyse ohne Voreingenommenheit.

Schematischer Überblick über das Versuchsprotokoll und die Analysetechniken, die für die markierungsfreie Bildgebung von Muskelabschnitten mithilfe von Synchrotron-Tief-Ultraviolettstrahlung verwendet werden. (a) Weitfeldmikroskopische Untersuchung (307–480 nm). Nach der Identifizierung der verschiedenen Muskelfaserklassen (beschriftete Bilder) wurden 5 Filter angewendet, um 5 unterschiedliche Bilder jeder Probe zu erhalten. Globale statistische Parameter wurden anhand der Rohpixelwerte dieser Bilder (Trainingsattribute) und Bildsätze (getestete Sätze) berechnet von Attributen) wurden zur Bewertung von 8 Modellen für maschinelles Lernen verwendet und mit unbeschrifteten Bildern getestet, um den am besten geeigneten Satz von Attributen und Algorithmen für maschinelles Lernen auszuwählen. (b) Bilder von Filter 4, der als beste Quelle für Attribute identifiziert wurde, wurden verwendet, um globale und lokale statistische Parameter zu extrahieren, um die beiden besten Algorithmen für maschinelles Lernen, Random Forest (RF) und Support Vector Machine (SVM), zu testen. (c) Mikrospektroskopie (300–540 nm). Ein sequenzieller Ansatz wurde verwendet, um die Umgebung der Fasern (Schritt 1) ​​und die Fasern innerhalb der Fasern (Schritt 2) zu messen und die entsprechenden Spektren zu erstellen (Schritt 3). Anschließend wurde eine Hauptkomponentenanalyse durchgeführt (Schritt 4).

Um die Autofluoreszenz im Skelettmuskelgewebe zu beurteilen, wurden 3 Proben aus jeder der 3 Hundegruppen der DISCO-Bildgebungsstrahllinie (280-nm-Anregung) für die Synchrotron-DUV-Strahlungsfluoreszenzmikroskopie ausgesetzt. Wir haben 5 komplementäre Emissionsfilter ausgewählt, um die Autofluoreszenz zu untersuchen, die der Tyrosin-, Tryptophan- und Kollagenvernetzung entspricht. Für jeden Muskelabschnitt wurde eine Reihe von Bildern erstellt, die den verschiedenen Mustern der Fluoreszenzkartierung entsprechen, die mit Komplementärfiltern erhalten wurden (Abb. 4). Auf den durch Anwendung des gleichen Kontrasts erzeugten Bildern wird die Fluoreszenzintensität mithilfe einer Farbskala ausgedrückt, die von Grün (geringe Intensität) bis Orange (hohe Intensität) reicht (blau-orange, ICB-Lookuptable auf Fidschi).

Synchrotron-Tief-Ultraviolettstrahlung für Untersuchungen in der Weitfeldmikroskopie. (a) Beispiele für Original-Rohbilder, die von gesunden (Golden Retriever; GR), dystrophischen (Golden Retriever-Muskeldystrophie; GRMD) und mit MuStem-Zellen behandelten dystrophischen GRMD-Hunden (GRMDT) unter Verwendung von 5 verschiedenen Emissionsfiltern und unterschiedlichen Wellenlängenintervallen aufgenommen wurden. (b) Entsprechende aggregierte Histogramme (dargestellt als Hüllkurve der Bins anstelle des herkömmlichen Bin-Satzes) für alle Filter und Hundegruppen. Maßstabsleiste: 100 µm.

Wie in Abb. 4a dargestellt, führten das niedrige Signal-Rausch-Verhältnis und das Vorhandensein unscharfer Faserumrisse dazu, dass es mit herkömmlicher Bildsegmentierung nicht immer möglich war, die Muskelfasern perfekt vom Bindegewebe zu isolieren. Daher wurde die Bildanalyse ohne Annahmen oder Vorkenntnisse über Merkmale durchgeführt. Auf die Bilder wurde eine statistische Charakterisierung von Pixel-Graustufen-Histogrammen angewendet, da ihre unimodalen Verteilungen und die Tatsache, dass im Vergleich quantitative Unterschiede je nach Hundetyp und Filter beobachtet werden können, beobachtet werden können. Für die drei Hundegruppen zeigten die Histogramme (dargestellt als Hüllkurve anstelle des herkömmlichen Satzes von Bins) für die Filter 1, 2 und 3 eine größere Variation der Graustufenintervalle und höhere Graustufenwerte, und ihre Kurven waren stark überlagert Ausmaß und Wahrscheinlichkeit, dass redundante Informationen generiert werden (Abb. 4b). Die Graustufenintervalle in den Histogrammen für die Filter 4 und 5 haben niedrigere Werte und höhere Zählwerte als die Filter 1, 2 und 3. Auch wenn die Filterhistogramme getrennt für die drei Hundegruppen untersucht wurden, erzeugten die Filter 4 und 5 zwei unterschiedliche Sätze von niedrige Fluoreszenzwerte, mit der doppelten Variation, die für Filter 4 im Vergleich zu Filter 5 beobachtet wurde (Abb. 5). Diese Beobachtungen legen nahe, dass aus den Graustufenhistogrammen differenzierende Informationen extrahiert werden könnten, um die vier Klassifizierungsfälle zu untersuchen. Angesichts der erhaltenen Histogramm-Morphologieelemente führten wir zunächst eine Bildanalyse unter Verwendung eines Satzes von 11 globalen statistischen Parametern (aufgelistet im Abschnitt „Material und Methode“; Abbildung S2) durch und testeten 8 überwachte Klassifizierungsansätze, um zu bestimmen, welcher Filter die besten Ergebnisse lieferte. Diese maschinellen Lernansätze entsprachen Entscheidungsbaum, k-nächsten Nachbarn, Bagging, adaptivem Boost, Gradient Boosting, Voting, Random Forest (RF) und Support Vector Machine (SVM). Die statistischen Parameter wurden anhand von insgesamt 13.380 Bildern von 5 Filtern berechnet, mit 892 Bildern jedes Filtertyps und für jede Hundegruppe (d. h. wenn ein Filter Attribute generiert, werden 1784 Bilder zur Klassifizierung von 2 Klassen und 2676 zur Klassifizierung von 3 Klassen verwendet). ). Die 4 Klassifizierungsfälle wurden getestet, wobei die 8 überwachten Klassifizierungsalgorithmen separat angewendet wurden, angepasst an kleine Datenmengen und an unseren Satz von Attributen (Abb. 3a). Die Datensätze wurden ausgeglichen und die Klassifizierungsalgorithmen wurden zunächst mit Standardparametern ohne Optimierung ausgeführt. Die überwachten Ansätze mit der besten Klassifizierungsgenauigkeit im Vergleich zu den anderen 6 Klassifizierungsalgorithmen waren RF bzw. SVM (Abb. 6a und b). RF verwendet eine Kombination aus Zufallsstichproben, Merkmalszufälligkeit und Ensemble-Lernen, um Daten zu analysieren. Ein Ensemble unabhängiger Entscheidungsbäume wird auf einer zufälligen Teilmenge von Trainingsdaten aufgebaut – um die Vielfalt zu erhöhen und Überanpassungen zu reduzieren – und auf Merkmalen, um zu verhindern, dass dominante Merkmale das Modell überwältigen. Anschließend werden Entscheidungsbäume erstellt, die Daten rekursiv aufteilen, indem die Homogenität der resultierenden Teilmengen optimiert wird. Eine Klassifizierung ergibt sich aus der Aggregation der einzelnen Baumausgaben, dh es wird die von den Bäumen am häufigsten vorhergesagte Klasse ausgewählt. SVM ist in einem hochdimensionalen Merkmalsraum linear oder nichtlinear trennbarer Daten definiert, wobei jeder Datenpunkt durch einen Vektor von Merkmalswerten dargestellt wird. Es wird eine Hyperebene definiert, die die interessierenden Daten in verschiedene Klassen unterteilt. Es ist durch einen Spielraum gekennzeichnet, der den maximalen Abstand zwischen der Hyperebene und den nächstgelegenen Datenpunkten jeder Klasse darstellt. Unterstützungsvektoren sind die Datenpunkte, die der Entscheidungsgrenze am nächsten liegen. Das trainierte Modell sagt die Klasse neuer Datenpunkte voraus, indem es bewertet, auf welcher Seite der Entscheidungsgrenze sie liegen.

Komplementäre Informationsdarstellung der tiefen Ultraviolettstrahlung des Synchrotrons nach Filtern. Aggregierte Histogramme der fünf Filter (dargestellt als Hüllkurve der Klassen anstelle des herkömmlichen Satzes von Klassen), die die Gruppen gesunder (Golden Retriever; GR), dystrophischer (Golden Retriever-Muskeldystrophie; GRMD) und MuStem-Zellen kombinieren. behandelte Hunde mit dystrophischer GRMD (GRMDT) für jeden Filter.

Klassifizierungsleistung (Genauigkeit) für Random Forest und Support Vector Machine. Die Eingabe für Random Forest (RF; a) und Support Vector Machine (SVM; b) bestand aus globalen statistischen Parametern, die aus Bildern extrahiert wurden, die mit jedem der 5 Filter für jede der 3 Hundegruppen (gesund [Golden Retriever; GR], dystrophisch) generiert wurden [Golden Retriever-Muskeldystrophie; GRMD] und MuStem-Zell-behandelte dystrophische GRMD-Hunde [GRMDT]) und diejenigen, die aus allen 5 Filtern zusammen extrahiert wurden. (c) Leistungsklassifizierungsdaten, die für die RF- und SVM-Ansätze erhalten wurden, wobei als Eingaben die Kombination globaler und komplementärer lokaler statistischer Parameter verwendet wurde, die nur für Bilder berechnet wurden, die mit Filter 4 der drei Hundeklassen aufgenommen wurden. In beiden Fällen (Standard- und optimierte Parameter) wurde eine k-fache Kreuzvalidierung mit k = 10 angewendet. Balken, die die Standardabweichung darstellen, werden nur für die optimierten RF- und SVM-Bedingungen angezeigt, da diese Werte in allen anderen Fällen sehr klein waren ( < 0,01 %).

Der RF-Algorithmus zeigte die größte Genauigkeit für den Fall GR vs. GRMD (81,23 %), gefolgt von GR vs. GRMDT (80,27 %), GRMD vs. GRMDT (74,40 %) und GR vs. GRMD vs. GRMDT (69,10 %). Der SVM-Algorithmus zeigte die größte Genauigkeit für GR vs. GRMDT (82,43 %), gefolgt von GR vs. GRMD (82,35 %), GRMD vs. GRMDT (74,63 %) und GR vs. GRMD vs. GRMDT (70,42 %). Die mit SVM erhaltenen Werte waren etwas höher als die mit RF erhaltenen. Die Klassifizierung der 25 möglichen Kombinationen von 2, 3, 4 und 5 Filtern ergab, dass Filter 4 alle anderen Optionen übertrifft. Ein Vergleich der 4 Klassifizierungsfälle ergab, dass GR vs. GRMD-Hunde und GR vs. GRMDT-Hunde unabhängig vom Filtertyp wahrscheinlich die am stärksten kontrastierenden Klassen waren: Abhängig vom verwendeten Klassifizierungsansatz entsprachen die besten Ergebnisse immer dem einen oder anderen dieser Fälle. Die Ergebnisse mit der niedrigsten Genauigkeit wurden für den Fall GR vs. GRMD vs. GMDT erhalten, unabhängig vom verwendeten Klassifizierungsalgorithmus. Für den Fall GRMD vs. GRMDT wurde eine mittlere Klassifizierungsleistung beobachtet. Als nächstes wurden die RF- und SVM-Klassifizierungsalgorithmen optimiert und für dieselben vier Klassifizierungsfälle ausgeführt, wobei die globalen und komplementären lokalen statistischen Parameter verwendet wurden, die aus mit Filter 4 generierten Bildern erhalten wurden. Jeder Klassifizierungsalgorithmus wurde durch automatisches Scannen von Wertintervallen optimiert, um die spezifischen Werte zu identifizieren Auswahl ausgewählter Parameter, die zur besten Leistung führten. Auf dem resultierenden Bewertungsraster wurden alle möglichen Kombinationen bewertet. Für RF waren die ausgewählten ausgewerteten Parameter die Anzahl der Bäume, die maximale Tiefe und das Kriterium. Für SVM waren die ausgewerteten Parameter ν (Regularisierung), ϵ (Fehlertoleranz), γ (Krümmung der Entscheidungsgrenze) und C (Strafe einer Fehlklassifizierung), wobei ein SVM-Typ C-Support Vector Classification (C-SVC) verwendet wurde ein Radial Basis Function (RBF)-Kernel. Im Vergleich zu Algorithmen, die mit Standardparametern ausgeführt wurden, führte die Optimierung zu einer Verbesserung der Klassifizierungsleistung von 9,30 % ± 2,13 % auf 15,19 % ± 2,52 %, was einer erheblichen Steigerung der Genauigkeit entspricht (Abb. 6c). Dies bestätigte die Gültigkeit der Anwendung von RF oder SVM auf die Kombination globaler und komplementärer lokaler statistischer Parameter für durch Filter 4 generierte Bilder. Für alle 4 Klassifizierungsfälle wurden Leistungsverbesserungen wie folgt beobachtet: GRMD vs. GRMDT (15,19 % ± 1,80 %) und GR vs. GRMD vs. GRMDT (15,19 % ± 2,52 %) für RF, gefolgt von GR vs. GRMD vs. GRMDT (13,98 % ± 2,37 %) und GRMD vs. GRMDT (11,51 % ± 1,79 %) für SVM. Verbesserungen der Klassifizierungsleistung (zwischen 9,30 und 10,43 %) wurden auch für GR vs. GRMD und GR vs. GRMDT (92,11 %) mit SVM sowie GR vs. GRMD (90,53 %) und GR vs. GRMDT (90,70 %) mit RF beobachtet. SVM übertraf RF in allen vier Fällen, wenn Standardparameter angewendet wurden. Allerdings schnitt SVM bei Anwendung der Optimierung in zwei Fällen (GR vs. GRMD und GR vs. GRMDT) etwas besser ab als RF. Bei der Optimierung zeigten beide Algorithmen im Fall GR vs. GRMD vs. GRMDT eine vergleichbare Leistung. Diese Ergebnisse belegen, dass eine Weitfeld-DUV-Mikroskopieanalyse mit niedriger spektraler Auflösung (60 nm) GR-, GRMD- und GRMDT-Hundemuskelproben basierend auf der bei 420 nm und 480 nm emittierten Autofluoreszenz effizient unterscheiden kann.

Basierend auf den ermutigenden Ergebnissen der Weitfeld-DUV-Mikroskopie versuchten wir, die spektrale Signatur der Muskeln der drei Hundegruppen mithilfe der Synchrotron-DUV-Mikrospektroskopie zu verfeinern. Dieser Ansatz ist zwar viel zeitaufwändiger, ermöglicht jedoch eine 40-mal höhere spektrale Auflösung als beim separaten Scannen von Muskelfasern und Bindegewebe mit der Weitfeldmikroskopie, dank der Scan-by-Point-Funktion, die auf dem mit der Hellfeldmikroskopie erhaltenen Bild durchgeführt wird. Mit dieser Technik haben wir das Bindegewebe und das Zytoplasma von Muskelfasern mit einer spektralen Auflösung von 0,5 nm analysiert (Abb. 7a). DUV-Spektraldaten wurden im Bereich von 300–540 nm in Muskelproben von drei gesunden GR-Hunden (blau), drei GRMD-Hunden (rot) und drei GRMDT-Hunden (grün) erfasst. Die Spektren wurden vorverarbeitet und einer multivariaten Datenanalyse unterzogen (The Unscrambler® X, CAMO Software Process AS). Es wurde eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchgeführt und die Ergebnisse in einem Score-Plot dargestellt, in dem jeder Punkt einem einzelnen aufgezeichneten Spektrum entspricht (Abb. 7b). Im Bindegewebe (oben) lassen sich im Score-Plot 3 Cluster entlang der PC-1-Achse (64 %) unterscheiden. Während blaue Flecken (GR) oberhalb der horizontalen Achse einen homogenen Cluster bildeten, bildeten rote Flecken (GRMD) eine große heterogene Gruppierung entlang der vertikalen negativen Achse. Interessanterweise verschmolz eine Gruppe grüner Flecken (GRMDT) mit der blauen Gruppe (GR), während eine zweite Gruppe grüner Flecken unterhalb der horizontalen Achse deutlich von den roten Flecken (GRMD) getrennt war. Das für das Zytoplasma der Muskelfasern erhaltene Score-Diagramm zeigte eine ausgeprägtere Trennung der dystrophischen Hundegruppen. Entlang der PC-1-Achse wurden drei deutlich unterschiedliche Cluster beobachtet, die den verschiedenen Hundegruppen entsprachen (67 %). Grüne Flecken (GRMDT) waren weitgehend von roten Flecken (GRMD) getrennt und zeigten ein hohes Maß an Überlappung mit blauen Flecken (GR). Als nächstes untersuchten wir das Belastungsdiagramm, in dem der Beitrag jeder Wellenzahl zur Häufung der Spektren von der positiven oder negativen Position relativ zur x-Achse des Belastungsdiagramms untersucht wurde (Abb. 7c). Bei Messungen im Bindegewebe zeigten wir, dass sich die Kollagenvernetzungsbande wie Pentosidin (355–480 nm) im negativen Teil des Belastungsdiagramms (unterhalb der x-Achse) befand, was auf eine größere Fluoreszenzintensität für GRMD (rote Punkte) als für GR hinweist (blaue Flecken) Hunde in einem Emissionsbereich, der bekanntermaßen ein Zeichen für die Kollagenvernetzung ist19. Interessanterweise war dies auch beim Vergleich mit GRMDT-Hunden (grüne Flecken) der Fall, mit Ausnahme eines Tieres (ID#2; Cluster umgeben). Darüber hinaus befand sich die charakteristische NADH-Bande (540–480 nm) im positiven Teil der Belastungskurve (oberhalb der x-Achse), was auf eine geringere NADH-Fluoreszenzintensität für GRMD (rote Punkte) im Vergleich zu GR-Hunden hinweist. Mit Ausnahme eines Tieres zeigten GRMDT-Hunde eine höhere NADH-Fluoreszenzintensität als GRMD-Hunde. Bei Messungen innerhalb von Fasern befand sich die charakteristische Emissionsbande von NADH im positiven Teil der Kurve (über der X-Achse), was auf eine vergleichbare Fluoreszenzintensität bei GRMDT-Hunden (grüne Flecken) und GR-Hunden (blaue Flecken) hinweist, die beide höher waren als das von GRMD-Hunden (rote Flecken). Das bei 460 nm im Belastungsdiagramm beobachtete spektrale Merkmal stützt weiterhin die Ansicht, dass NADH-Autofluoreszenz GRMD-Hundemuskelproben effektiv von denen von GR- und GRMDT-Hunden unterscheiden kann. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass DUV-Mikrospektroskopiedaten verwendet werden können, um GRMD-Hunde von den beiden anderen Gruppen zu unterscheiden, basierend auf einer geringeren NADH-Fluoreszenzintensität (540–480, 460 nm) in den Muskelfasern und einer höheren Fluoreszenzintensität im Zusammenhang mit der Kollagenvernetzung (480). –355 nm) im Bindegewebe. Wichtig ist, dass wir zum ersten Mal eine klare Trennung zwischen GRMDT- und GRMD-Hundeclustern zeigen, wobei ein erster Cluster Bindegewebsdatenpunkte für 2 von 3 GRMDT-Hunden und 3 GR-Hunden umfasst und ein zweiter Cluster Zytoplasmafaser-Datenpunkte für alle GRMDT- und GRMDT-Hunde umfasst GR-Hunde. Diese Ergebnisse unterstreichen den positiven Einfluss der MuStem-Zelltransplantation auf den Muskelphänotyp von GRMD-Hunden.

Untersuchung des Zytoplasmas von Bindegewebe und Muskelfasern mittels Synchrotron-Mikrospektroskopie mit tiefer ultravioletter Strahlung. (a) Spektraldaten im tiefen Ultraviolett (DUV) wurden zwischen 300 und 540 nm für Bindegewebe (oben) und Faserzytoplasma (unten) im Skelettmuskel von 3 Tieren pro Hundegruppe erhalten: gesund [Golden Retriever; GR], dystrophisch [Golden-Retriever-Muskeldystrophie; GRMD] und mit MuStemzellen behandelte dystrophische GRMD [GRMDT]. (b) Die Daten wurden mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) analysiert, vorverarbeitet (Einheitsvektornormalisierung) und einer multivariaten Datenanalyse unterzogen (The Unscrambler® X; CAMO Software Process AS). Die Ergebnisse, die für gesunde GR- (blau), GRMD- (rot) und GRMDT-Hunde (grün) erzielt wurden, wurden durch ein Punktediagramm dargestellt, in dem jeder Punkt einem einzelnen Spektrum entspricht. Im Bindegewebe (oben) wurden in den Score-Plots 3 Cluster getrennt: (i) entlang der PC-1-Achse Trennung von GRMD-Hunden (rot; auf dem negativen Teil von PC-1 gelegen) von gesunden GR-Hunden (blau) und Teil der GRMDT-Hunde (grün), beide liegen auf der positiven Seite der PC-1-Achse; (ii) entlang der PC-2-Achse GRMD-Hunde (rot) und ein Teil der GRMDT-Hunde (grün; umgeben), die rechts von der PC-2-Achse einen Cluster bildeten. Gesunde GR-Hunde (blau) und ein Teil der GRMDT-Hunde (grün) wurden auf beiden Seiten der PC-2-Achse verteilt. Im Zytoplasma der Muskelfasern (unten) wurden zwei Cluster getrennt: (i) entlang der PC-1-Achse, Trennung von GRMD-Hunden (rot; auf dem negativen Teil von PC-1 gelegen) von gesunden GR-Hunden (blau) und ein GRMDT Hund (grün), beide verschmolzen und auf der positiven Seite der PC-1-Achse gelegen; (ii) Entlang der PC-2-Achse bildeten GRMD-Hunde (rot) einen Cluster rechts von der PC-2-Achse, während die meisten gesunden GR-Hunde (blau) und GRMDT-Hunde (grün) auf beiden Seiten der PC-2-Achse verteilt waren. (c) Es wurden auch Belastungsdiagramme erstellt, in denen der Beitrag jeder Wellenzahl zur Clusterung der Spektren untersucht wurde. Die entsprechenden Beladungsdiagramme zeigten die wichtigsten charakteristischen Emissionsbanden der Kollagenvernetzung (oben) und NADH (unten).

In dieser Studie liefern wir originelle und überzeugende Daten, die die Fähigkeit der DUV-Strahlung zur Unterscheidung von beschädigtem Skelettmuskelgewebe belegen und ihr Potenzial zur Charakterisierung dystrophischer Gewebeumgestaltung hervorheben. Unsere Daten zeigen, dass eine statistische Analyse endogener Fluoreszenzintensitätshistogramme, die bei verschiedenen Wellenlängen aus DUV-Weitfeldmessungen gesammelt wurden, ein gültiger, unvoreingenommener Ansatz zur Verarbeitung der Gesamtheit des vom Gewebeschnitt erzeugten Signals ist. Tatsächlich ermöglichte uns dieser Ansatz, der zum ersten Mal an einem Synchrotron-Datensatz durchgeführt wurde, die Unterscheidung der Skelettmuskulatur naiver GRMD-Hunde von denen von GRMD-Hunden, die sich einer adulten Stammzelltransplantation unterzogen hatten, im Gegensatz zu den Ergebnissen, die mit herkömmlichen quantitativen histologischen Techniken erzielt wurden. Darüber hinaus wurde die Unterscheidungskraft von DUV-Weitfelddaten mithilfe der DUV-Mikrospektroskopie bestätigt, die sich durch ein hohes Maß an spektraler Auflösung auszeichnet, was den experimentellen Ansatz validiert. Wir verwendeten DUV-Strahlungsbilder, um zum ersten Mal mit hoher Genauigkeit die folgenden Gruppen zu unterscheiden: GR vs. GRMDT, GRMD vs. GRMDT und GR vs. GRMD vs. GRMDT, abgesehen von den bereits gut klassifizierten GR vs. GRMD-Hundegruppen. Trotz der Schwierigkeiten, die Form von Fasern durch Bildsegmentierung korrekt zu bestimmen, und der damit verbundenen Unmöglichkeit, Fasern nach geometrischen Merkmalen zu klassifizieren, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass kombinierte globale und lokale statistische Parameter geeignete Attribute für überwachtes maschinelles Lernen liefern. Auf biologischer Ebene haben wir gezeigt, dass die MuStem-Zelltransplantation in einem Tiermodell der Dystrophie zu einer Organisation des Kollagennetzwerks führen kann, die der bei gesunden Tieren ähnlicher ist. Zusammengenommen beschreiben diese Ergebnisse eine neue Modalität der mikroskopischen Untersuchung dystrophischer Muskelproben, die sehr wenig Gewebe erfordert, markierungsfrei und hochempfindlich ist und eine tiefergehende Analyse der Gewebeumgestaltung ermöglicht. Darüber hinaus liefern die Ergebnisse einen weiteren Beweis für die Fähigkeit von MuStem-Zellen, dystrophische Muskeln langfristig nach systemischer Verabreichung positiv umzugestalten, wobei hier insbesondere eine Auswirkung auf das Bindegewebe 5 Monate nach der Verabreichung beobachtet wurde. Dies bestärkt die Idee einer pleiotropen Wirkung dieser adulten Stammzellen, wie sie in unseren früheren Studien mit unvoreingenommenen Omic-Ansätzen hervorgerufen wurde25,26. Insgesamt festigen unsere Ergebnisse die MuStem-Zelltransplantation als vielversprechende Kandidatentherapie für DMD.

Ein Schlüsselmerkmal der DUV-Strahlungsmikroskopie/Mikrospektroskopie ist das Fehlen einer Markierung mit externen Sonden (z. B. Farbstoffen und Antikörpern), die Quellen experimenteller und/oder artspezifischer Artefakte sein können. Dies verleiht der Technik einen universellen Charakter, der sich besser für den Vergleich von Studien eignet, die in verschiedenen Labors durchgeführt wurden. Ein zweiter wesentlicher Vorteil der Technik besteht darin, dass sie eine geringe Menge an Gewebematerial erfordert, was insbesondere bei der Arbeit mit menschlichen Proben häufig ein limitierendes Element darstellt. Der Nachteil der Untersuchung eines begrenzten Muskelbereichs besteht darin, dass dieser möglicherweise nicht repräsentativ für den Zustand des Gewebes ist, weder in präklinischen noch in klinischen Studien, und die Idee, mehrere Bereiche parallel zu nutzen, muss berücksichtigt werden, um sicherzustellen, dass die Daten gewährleistet sind Das erzeugte Bild spiegelt den Gesamtzustand des Gewebes getreu wider.

Mithilfe der DUV-Weitfeldmikroskopie und Mikrospektroskopie haben wir gezeigt, dass die Analyse der vom Bindegewebe emittierten endogenen Fluoreszenz GR-, GRMD- und GRMDT-Hundemuskeln mit hoher Genauigkeit unterscheiden kann. Dies ist besonders interessant, da die Endomysialfibrose eines der wichtigsten histopathologischen Merkmale bei der Entwicklung von DMD29,30,31 ist. Der von Bindegewebe eingenommene Bereich in Querschnitten dystrophischer Muskeln, die zuvor mit Picrosirius-Rot, WGA gefärbt oder auf Kollagen I immunmarkiert wurden32,33,34, wird routinemäßig quantifiziert, um Informationen über den Krankheitsverlauf zu erhalten und/oder den Einfluss von Genen oder Zellen zu beurteilen Therapiestrategien in präklinischen Studien10,35,36. Unsere Ergebnisse, die aus einem auf DUV-Strahlung basierenden Ansatz stammen, der zum ersten Mal an dystrophischen Hundemuskeln durchgeführt wurde, konsolidieren die vorherigen Ergebnisse und zeigen, dass die Organisation des Kollagennetzwerks neben dem Fibrosebereich ein wichtiges Kriterium ist, das bei der Untersuchung berücksichtigt werden muss Umbau dystrophischer Muskeln. Interessanterweise ermöglichte die Analyse der auf das Bindegewebsgerüst gerichteten DUV-Strahlung die Unterscheidung zwischen GRMDT- und GRMD-Muskeln, während bei der Betrachtung des Endomysialgewebebereichs mit herkömmlichen histopathologischen Ansätzen keine signifikanten Unterschiede festgestellt wurden. Dies deutet auf eine höhere Empfindlichkeit des DUV-Ansatzes hin. Diese Originaldaten wurden hier am Musculus biceps femoris gewonnen, daher wäre es aufschlussreich zu definieren, ob identische Ergebnisse in anderen dystrophischen Muskeln gefunden werden, die möglicherweise einen anderen Läsionsphänotyp aufweisen, um den Grad der Unterscheidung der Messung zu ermitteln. Es ist auch erwähnenswert, dass qualitative Veränderungen im Fasergewebe (d. h. der Grad der Kollagenvernetzung) Berichten zufolge eine wichtige funktionelle Rolle bei dystrophischen Muskeln spielen14,15, was die Relevanz der hier präsentierten DUV-Strahlungsdaten weiter unterstreicht. Beispielsweise trägt die architektonische Organisation des Kollagennetzwerks maßgeblich zur Muskelsteifheit bei DMD-Patienten sowie bei den mdx-Maus- und GRMD-Hundemodellen bei11,12. Eine kürzlich durchgeführte Studie unter Verwendung von Polarisationslichtmikroskopie oder Mikroskopie der zweiten harmonischen Generation ergab keine eindeutige Korrelation zwischen dem Grad der Kollagenfaserausrichtung und dem Kriterium der Muskelelastizität12. Basierend auf den unterschiedlichen Spektraldaten, die für GRMD- und GRMDT-Hunde erhalten wurden, wäre es interessant, eine funktionelle Untersuchung und eine DUV-Strahlungsanalyse unter Verwendung derselben isolierten Muskeln durchzuführen, um den Zusammenhang zwischen durch MuStem-Zelltransplantation verursachten Bindegewebsveränderungen und Muskelsteifheit und -elastizität zu untersuchen. Mithilfe der DUV-Mikrospektroskopie zur Durchführung hochauflösender Spektralmessungen im Bindegewebe haben wir für zwei der drei GRMDT-Hunde Spektren erhalten, die denen aus GR-Hundeproben ähneln, was auf eine unterschiedliche Reaktion auf Zelltransplantation hindeuten könnte. Dennoch ist zu beachten, dass die Messungen an einem einzigen Muskeltyp, dem Musculus biceps femoris, durchgeführt wurden und keine Korrelation mit den Ergebnissen für die anderen bewerteten Kriterien, d. h. klinischer Score und Regenerationsaktivität, bestand. In Übereinstimmung mit mehreren Studien, die phänotypische Variabilität bei GRMD-Hunden berichten25,37, könnte dieses Ergebnis auch eine ausgeprägtere Läsionsintensität bei einem der in die Studie einbezogenen GRMD-Hunde widerspiegeln.

Neben der Kollagenvernetzung gehören Tryptophan, Tyrosin und NADH zu den am häufigsten vorkommenden autofluoreszierenden Molekülen, die in Muskeln beobachtet werden, die DUV-Strahlung ausgesetzt sind19,38. Ein weiteres wichtiges Ergebnis unserer Studie ist, dass Spektraldaten, die NADH im Zytoplasma von Muskelfasern entsprechen, GRMDT deutlich von GRMD-Hundemuskeln unterscheiden, sie aber auch mit denen von GR-Hunden gruppieren, was darauf hindeutet, dass dieser Parameter nach dem Zellabgabeprotokoll wieder zum Normalwert zurückkehrt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die mit NADH in den Muskelfasern verbundene DUV-Autofluoreszenzintensität einen zweiten Biomarker für die positive Wirkung der MuStem-Zelltransplantation darstellen könnte.

DUV-Mikrospektroskopiemessungen, die auf der Ebene des Bindegewebes und des Muskelfaserzytoplasmas durchgeführt wurden, weisen auf einen signifikanten Anstieg der Autofluoreszenz im Zusammenhang mit der Kollagenvernetzung und einen damit einhergehenden signifikanten Rückgang der NADH-Autofluoreszenzintensität im Muskel von GRMD-Hunden im Vergleich zu GR-Hunden hin. Diese Beobachtungen stimmen mit den Ergebnissen mehrerer Studien überein, die zeigen, dass eine Veränderung der Kollagenvernetzung11,39 und eine mitochondriale Dysfunktion40,41 mit DMD verbunden sind. Wir haben kürzlich eine signifikante Desorganisation des Kollagennetzwerks im Herzmuskel von dystrophischen Ratten nachgewiesen, was durch Polyorientierung, Verdichtung und Verkürzung der Fasern belegt wurde16. In der vorliegenden Studie berichten wir über Veränderungen in der Kollagenvernetzung und im NADH, das überwiegend aus den Mitochondrien stammt, wo es der ATP-Synthese dient, im GRMD-Muskel nach der systemischen Abgabe von MuStem-Zellen, mit entsprechenden spektralen Eigenschaften, die denen ähneln, die in erhalten wurden GR-Hundemuskel. Diese Ergebnisse stimmen mit unseren früheren Omics-Studien zu den Folgen der MuStem-Zelltransplantation überein und zeigen einen Einfluss auf mehrere biologische Prozesse, einschließlich der strukturellen Integrität von Muskelbündeln durch Wirkung auf der Ebene der Faserarchitektur, der extrazellulären Matrixorganisation und des Energiestoffwechsels25. 26. Mehr als 6 Monate nach der intraarteriellen Abgabe von MuStem-Zellen bei GRMD-Hunden hat die quantitative Proteomik von Nekropsien des Biceps femoris-Muskels signifikante Veränderungen im Kollagen-I-Gehalt und in der Anreicherung genontologischer Begriffe, einschließlich des Oxidationsreduktionsprozesses und des ATP-Stoffwechselprozesses, ergeben und Mitochondrium, verglichen mit Daten, die beim naiven GRMD-Hund erhalten wurden26. Interessanterweise wurden verschiedene NADH-Dehydrogenase-Untereinheiten nach Zelltransplantation als deutlich unterrepräsentierte Proteine ​​identifiziert.

Unsere Studie zeigt, dass die DUV-Strahlungsmikroskopie/Mikrospektroskopie ein leistungsstarkes Werkzeug zur markierungsfreien Untersuchung von Muskelabschnitten für präklinische Studien darstellt. Dennoch könnten bestimmte Verbesserungen zur Optimierung der Synchrotron-DUV-Erfassung dazu beitragen, die Unterscheidungskraft weiter zu erhöhen. Die Bildaufnahme mit dual-optimalen Anregungswellenlängen könnte eine spezifischere Untersuchung der Kollagenvernetzung und NADH ermöglichen. Darüber hinaus würde ein spezifischerer Emissionsfilter-Bandpass eine stärkere Trennung der Fluoreszenzemission und damit eine bessere Unterscheidung zwischen Muskeln von GR-, GRMD- und GRMDT-Hunden ermöglichen. Angesichts der Größe des in der vorliegenden Studie verwendeten Datensatzes haben wir überwachtes maschinelles Lernen mit Feature-Engineering angewendet. Unsere Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass es möglich ist, die Klassifizierungsleistung zu verbessern. Eine Alternative zu optimierten Klassifizierungsmodellen wäre die automatische und unbeaufsichtigte Definition der geeigneten DUV-Strahlungsbildmerkmale mittels Repräsentationslernen unter Verwendung eines Deep-Learning-Ansatzes wie Autoencoder. Dies würde Studien mit einem DMD-Tiermodell erfordern, das eine größere Stichprobengröße ermöglicht als mit GRMD-Hunden, wie der DMDmdx-Ratte, die zunehmend in präklinischen Studien verwendet wird35,42, um die Größe des Bildes zu erhöhen. zugehörigen Datensatz.

Wir beschreiben die Verwendung von DUV-Strahlung in Kombination mit Weitfeldmikroskopie und Mikrospektroskopie, um die erste unvoreingenommene Analyse der endogenen Fluoreszenz in dystrophischen Muskeln durchzuführen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass DUV-Synchrotronstrahlung, die in der Weitfeldmikroskopie und Mikrospektroskopie verwendet wird, ein empfindliches Werkzeug darstellt, das klassische Histomorphometrie-Ansätze ergänzt und die Charakterisierung dystrophischer Muskeln und die effiziente Bewertung zellbasierter Therapiestrategien erleichtert.

Insgesamt wurden 12 männliche, 2,5 Monate alte Golden Retriever (GR)-Hunde in diese Studie einbezogen. Alle Hunde wurden vom Centre d'Elevage du Domaine des Souches (CEDS, Mezilles, Frankreich) oder vom Boisbonne Centre for Gen and Cell Therapy (Oniris, Nantes, Frankreich) bezogen. Die Hunde wurden im Boisbonne Centre in einer kontrollierten Umgebung gehalten (Temperatur 21 ± 1 °C, 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus). Hunde mit Golden-Retriever-Muskeldystrophie (GRMD) wurden bei der Geburt mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierten Genotypisierung identifiziert, wie zuvor beschrieben43. Für klinische und/oder pathophysiologische Studien wurden drei Gruppen (N = 4 Tiere pro Gruppe) erstellt (Tabelle 1): GRMD-Hunde, behandelt mit MuStem-Zellen und Immunsuppressiva (IS) (GRMDT; Nr. 1 bis Nr. 4); GRMD-Hunde, die nur IS erhalten (GRMD; Nr. 5 bis Nr. 8); und gesunde Hunde (GR; Nr. 9 bis Nr. 12). Die Studie wurde gemäß den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren des französischen Nationalen Forschungsrats durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Ethikkommission für Tierversuche der Region Pays de la Loire, Frankreich, genehmigt (Genehmigungsnummer: CEEA.2012.104). Darüber hinaus wurde die Studie in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org) durchgeführt. Alle Operationen wurden unter Anästhesie durchgeführt, die mit Ketamin (Imalgene 1000, Merial, Toulouse, Frankreich)/Diazepam (Valium, Roche, Boulogne-Billancourt, Frankreich) eingeleitet und mit einer inhalativen Mischung aus Isofluran (Vetflurane, Virbac, Magny-en) aufrechterhalten wurde -Vexin, Frankreich) und Sauerstoff. Um das Leiden zu minimieren, wurde eine Analgesiebehandlung mit Tolfenaminsäure (4 mg/kg, Tolfedine, Vetoquinol SA, Magny Vernois, Frankreich) durchgeführt. Im Rahmen einer vollständigen klinischen Untersuchung durch einen Tierarzt wurden die Schmerzen täglich beurteilt und bei Bedarf eine Analgesie verabreicht. Hunde wurden durch intravenöse Verabreichung von Natriumpentobarbital (2000 mg; Dolethal, Vetoquinol SA, Magny Vernois) eingeschläfert.

Wildtyp-MuStem-Zellen, die verzögert adhärenten Stammzellen entsprechen, wurden wie zuvor beschrieben aus den Muskeln der Hinterbeine von 10 Wochen alten gesunden Hunden isoliert10. Die Zellen wurden bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert und alle 4 bis 5 Tage passagiert, wenn sie eine Konfluenz von etwa 75 % erreichten. Das Wachstumsmedium wurde alle 2 Tage ausgetauscht.

Die Immunsuppression von GRMD- und GRMDT-Hunden wurde durch die tägliche Verabreichung von 27 mg/kg oralem CsA (Neoral®; Novartis, Rueil-Malmaison, Frankreich) in Kombination mit 6 mg/kg Mycophenolatmofetil (CellCept®; Roche, Paris, Frankreich) erreicht. . Ketoconazol (10 mg/kg; Nizoral®; Janseen-Cilag, Issy-les-Moulineaux, Frankreich) wurde ebenfalls täglich hinzugefügt, um den CsA-Katabolismus zu verringern. Der CsA-Blutspiegel wurde zweimal pro Woche überwacht und durch individuelle Dosisanpassungen zwischen 250 und 350 ng/ml gehalten. Das immunsuppressive Regime wurde eine Woche vor der Verabreichung von MuStem-Zellen begonnen und während der gesamten Studie beibehalten.

MuStem-Zellen wurden bei Passage 5 (P5) oder 6 (P6) verwendet, was Zellen entspricht, die zwischen 22 und 27 kumulative Populationsverdoppelungen durchlaufen haben. Zellsuspensionen wurden mit einem Dichtebereich von 12–18 × 106 Zellen/ml in 0,9 % NaCl / 2,5 % homologem Serum / 10 IU/ml Heparin hergestellt. Bei immunsupprimierten GRMD-Hunden (GRMDT; Nr. 1 bis Nr. 4) wurden ab einem Alter von 11,0–18,2 Wochen drei Injektionen von 5,5–8,0 × 107 Zellen/kg in die Kopfvenen in Abständen von 10 bis 12 Tagen durchgeführt (Tabelle 1). unter Verwendung einer laminaren Strömung mit einer Geschwindigkeit von 12–15 ml/min, wie zuvor beschrieben10.

Die Hunde wurden während des gesamten Versuchsprotokolls wöchentlich von einem Tierarzt nicht verblindet klinisch untersucht, wobei eine modifizierte Version des zuvor beschriebenen Rasters verwendet wurde10,43. Kurz gesagt wurde ein klinischer Score basierend auf 11 Fortbewegungs- und Muskelkriterien und 6 Elementen im Zusammenhang mit dem allgemeinen Gesundheitszustand erstellt. Die Punktzahl wurde als Prozentsatz der maximalen Punktzahl von 100 % für alle gesunden Hunde ausgedrückt.

Bei 36,0 bis 47,4 Wochen alten Hunden wurden kleine Stücke (0,5 cm3) von Nekropsien des Biceps femoris-Muskels chirurgisch aus dem mittleren Teil des Muskels entnommen, mit Ausnahme eines Hundes, der aus ethischen Gründen nach 33,6 Wochen eingeschläfert und für histologische Zwecke verwendet wurde Analysen. Dieser Zeitpunkt entspricht 5,0–6,7 Monaten nach Beginn des Zelltransplantationsprotokolls. Muskelproben wurden in Isopentan (VWR International, Fontenay-sous-Bois, Frankreich) schockgefroren, in flüssigem Stickstoff abgekühlt und bis zur Verarbeitung bei -80 °C gelagert. Zur histologischen Färbung und Fluoreszenzimmunmarkierung und anschließenden Analyse mit einem Objektträgerscanner (Axioscan Zeiss, Jena, Deutschland) wurden serielle transversale 8 μm dicke Kryostatschnitte auf Glasobjektträger gelegt. Darüber hinaus wurden serielle transversale 10 μm dicke Kryostatenschnitte auf Quarzobjektträgern für die Tief-Ultraviolett-Mikroskopie (DUV) und DUV-Mikrospektroskopie (Synchrotron DISCO-Strahllinie, Soleil, Frankreich) platziert.

Serielle Muskelsekten. (8 μm) wurden mit Hämatoxylin-Eosin-Safran (HES), Picrosirius-Rot und Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Dehydrogenase-Tetrazolium-Reduktase (NADH-TR) gefärbt, um Informationen über die Muskelbündelorganisation, den Bindegewebsgehalt und die Mitochondrienverteilung zu erhalten. Um die endomysiale Fibrose gezielt zu untersuchen, wurden Schnitte über Nacht bei 4 °C mit Alexa-Fluor 555-konjugiertem Weizenkeim-Agglutinin (WGA; 1:500, W32464; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) nach Permeabilisierung mit 0,1 % Triton X- inkubiert. 100 (Sigma-Aldrich, Saint Quentin-Fallavier, Frankreich) und Inkubation mit Blockierungspuffer (Mischung aus 5 % Ziegenserum und 5 % Rinderserumalbumin in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS], Sigma-Aldrich). Um die Muskelregenerationsaktivität zu beurteilen, wurden die Schnitte wie oben beschrieben permeabilisiert und gesättigt und dann über Nacht bei 4 °C mit Antikörpern inkubiert, die gegen die Entwicklungsisoform der schweren Kette von Myosin (MyHCd; 1:100, NCL-MHCd; Novocastra) und Alexa-Fluor gerichtet waren 555-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:300, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). Zur Quantifizierung der MyHCd+-Fasern wurden 5 interessierende Regionen mit jeweils 100 bis 300 Fasern in einem gesamten histologischen Schnitt von jeweils 4 Hunden pro Gruppe berücksichtigt, um einen Satz von 500 bis 1500 Fasern pro Hund zu analysieren. Die histologischen Schnitte wurden von einem Veterinärpathologen gelesen und analysiert, der vom Europäischen Ausschuss des Fachgebiets zertifiziert wurde.

Bilder, die dem gesamten Abschnitt jeder Gewebeprobe entsprechen, wurden mit einem Objektträgerscanner (AxioScan.Z1, Zeiss, Jena, Deutschland) mit Fluoreszenz- und Hellfeld-Bildgebungsmodi (Plan Apochromat 10X-Objektiv) aufgenommen. Die Hellfeld-Bildgebung wurde mit LED-Beleuchtung und Tri-CDD-Hitachi-Kameraerkennung durchgeführt. Die Fluoreszenzbildgebung wurde mit XCITE LED FIRE-Beleuchtung, Emissionsbandpass (EM BP 445/50 (DAPI), EM BP (525/50 [Alexa-Fluor 488] und EM BP 605/70 [Alexa-Fluor 555]) durchgeführt. Die Histomorphometrie wurde mithilfe der Fiji-Software durchgeführt. Die der WGA-Fluoreszenzmarkierung entsprechende Oberfläche wurde im Endomysium gemessen. Der Anteil der MyHCd+-Fasern wurde in Muskelabschnitten der 4 Hunde in jeder Gruppe quantifiziert, wobei mindestens 500 Fasern pro Gruppe berücksichtigt wurden. Statistische Analysen wurden durchgeführt durchgeführt mit GraphPad Prism v6.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).

Die Synchrotron-UV-Fluoreszenzbildgebung wurde an der DISCO-Beamline der SOLEIL-Synchrotronstrahlungsanlage (Saint-Aubin, Frankreich)44 durchgeführt. Die DISCO-Synchrotron-Beamline verfügt über eine experimentelle Bildgebungsstation, an der der Ablenkmagnet DUV-Strahlung im sichtbaren Bereich liefert, die kontinuierlich von 180–600 nm (1,2–10 eV) abstimmbar ist. Viele aromatische Gruppen und Enzyme lumineszieren auf natürliche Weise unter UV-Anregung ohne äußere Marker. Dadurch eignet sich die DISCO-Beamline gut für die In-situ-Untersuchung biomedizinischer Proben durch Analyse der intrinsischen Fluoreszenz von Molekülen45,46.

Gefrorener Musculus biceps femoris im Querschnitt. (10 µm) von 4 GR-, 4 GRMD- und 4 GRMDT-Hunden wurden analysiert. Für die DUV-Bildgebung wurden die Schnitte auf Quarzobjektträger gelegt. Das Synchrotron-Weitfeld-DUV-Bildgebungssystem basiert auf einem inversen Zeiss Axio Observer Z1 (Carl Zeiss) mit reiner Quarzoptik. Der weiße Strahl der DISCO-Strahllinie am Synchrotron SOLEIL wird von einem iHR320 (Jobin-Yvon Horiba) monochromatisiert, bevor er mit dem Eingang des modifizierten Zeiss Axio Observer Z1 gekoppelt wird. Der monochromatische Strahl wurde auf 280 nm eingestellt. Ein scharfer dichroitischer Spiegel, der nur über 300 nm durchlässt (Omega Optical), reflektierte das einfallende Licht, bevor es durch ein Zeiss Ultrafluar 40X (NA 0,6, Glycerinimmersion) auf die Probe fokussiert wurde. Die Emission wurde mit einer Pixis 1024-BUV-Kamera (Princeton Instruments) aufgezeichnet, nachdem sie eine Reihe von Bandpassfiltern durchlaufen hatte (307–323 nm, 327–353 nm, 370–410 nm, 420–480 nm und 435–455 nm; Semrock, IDEX Health & Science, LLC). Diese Kanäle wurden entsprechend den aromatischen Gruppen ausgewählt, die bei diesen Wellenlängen fluoreszieren, wodurch das Vorhandensein verschiedener Aminosäuren, Proteine ​​oder Kollagenvernetzung in Verbindung gebracht werden kann. So wurde der erste Kanal an das Vorhandensein von Tyrosin angepasst, der zweite und dritte an das Vorhandensein von Tryptophan und schließlich die letzten beiden an die Kollagenvernetzung19. Fluoreszenzbilder wurden typischerweise mit Belichtungszeiten von 1–5 s aufgenommen. Die Bilder wurden mit einem 40X-Objektiv (0,276 µm/Pixel) aufgenommen. Zum Zusammenfügen wurde ein zentrierter Interessenbereich (404 × 424 Pixel entsprechend 111 µm × 117 µm) der Kamera ausgewählt. Daher wurden keine Stitching-Artefakte oder Schattierungen beobachtet, was die Erzeugung großer Bilder mit 36 ​​kleineren Bildern (350 × 350 Pixel) ermöglichte (Beispiel: 2424 × 2544 Pixel = 666 µm × 702 µm). Pro Probe wurden einhundertvierundvierzig Bilder aufgenommen. Abbildungen von DUV-Weitfeldmikroskopie-Aufnahmen wurden mit der Fiji-Software durchgeführt47.

Es wurden maschinelle Lernalgorithmen eingesetzt, da sich die komplexen und variablen relevanten Merkmale von Autofluoreszenzbildern zur Identifizierung der drei interessierenden Klassen nur sehr schwer manuell oder durch die Anwendung von Segmentierungsalgorithmen definieren lassen, wohingegen sie durch Lernansätze effizienter erfasst werden können. In Anbetracht der Tatsache, dass die statistischen Parameterwerte jedes Bildes nur eine Hundeklasse darstellen (unabhängig vom Filtertyp), wurden Muster in den DUV-Bildern durch das Training überwachter Klassifizierungsmodelle bewertet, die an kleine Datenszenarien angepasst sind, wobei beschriftete Beispiele jeder der drei Klassen zur Analyse verwendet wurden 4 Klassifizierungsprobleme: GR vs. GRMD, GR vs. GRMDT, GRMD vs. GRMDT und GR vs. GRMD vs. GRMDT. Globale statistische Parameter, die für die Histogramme aller Filter für jede der drei Klassen berechnet wurden, wurden verwendet, um die vier Klassifizierungsprobleme anzugehen, und acht überwachte Klassifizierungsansätze wurden getestet: Entscheidungsbaum, k-nächste Nachbarn, Bagging, adaptive Boost, Gradient Boosting, Abstimmung , Support Vector Machine (SVM) und Random Forest (RF) (Abb. 3a). Basierend auf den Ergebnissen haben wir den Filter mit der besten Klassifizierungsleistung sowie die entsprechenden Klassifizierungsansätze identifiziert. Anschließend wurden komplementäre lokale statistische Parameter aus den Histogrammen des Filters mit der besten Klassifizierungsleistung berechnet und mit den jeweiligen globalen statistischen Parametern kombiniert (Abbildung S2), um als Eingaben für die Klassifizierungsansätze mit der besten Leistung verwendet zu werden. Algorithmen für maschinelles Lernen wurden mit der Programmiersprache Python und einigen Bibliotheken wie OpenCV (Open Computer Vision), NumPy (numerische Programmierung), Pandas (Datenanalyse), Scikit-Learn (maschinelles Lernen), PIL (Bildmanipulation) und Matplotlib ( Visualisierung).

Die Gewebeschnitte wurden ohne spezifisches Eindeckmedium auf kreisförmige Quarzobjektträger für die DUV-Bildgebung gelegt (Durchmesser 12,7 mm, Dicke 0,17 mm, ESCO Optics, New Jersey, USA). Ein monochromatischer Strahl bei 280 nm wurde durch ein 40X-Objektiv (Ultrafluar, Zeiss, Deutschland) verwendet und die Wiederherstellung der Fluoreszenz wurde zwischen 300 und 540 nm mit einer spektralen Auflösung von 0,5 nm durchgeführt. Das Spektrum wurde bis 530 nm ausgewählt, um die charakteristische NADH-Bande zu untersuchen19. Zur getrennten Analyse von Faser- und Bindegewebe wurde eine Einzelpunktuntersuchung durchgeführt. Insgesamt wurden 230 Spektren pro Region (Faserzytoplasma und Bindegewebe) und pro Tier aufgenommen, wobei 3 Hunde pro Gruppe (GR, GRMD, GRMDT) verwendet wurden. Die Spektraldaten wurden mit dem multivariaten Datensatz The Unscrambler® X (CAMO Software Process AS) analysiert. Die Spektren wurden in einer gleichen Matrix gruppiert. Arbeitsmatrizen wurden durch Sammeln von Proben aus denselben Hundegruppen erstellt. Sechshundertneunzig Spektren pro Hundegruppe wurden gemäß der Einheitsvektornormalisierungsmethode vorverarbeitet, um jedes Spektrum einzeln vergleichen und eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Varianz zwischen den Spektren durchführen zu können. Während die Score-Diagramme einen Vergleich der DUV-Spektren ermöglichten, zeigten die entsprechenden Belastungsdiagramme die wichtigsten charakteristischen Emissionsbanden hinter der Häufung der Spektren.

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Die Daten wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Tukey-Mehrfachvergleichstest analysiert. Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism v6.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Ein p-Wert ≤ 0,05 wurde als signifikant angesehen. Globale und lokale statistische Parameter für die Bildklassifizierung wurden mit der Programmiersprache Python und der Bibliothek scipy.stats (statistische Funktionen) berechnet.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Die Autoren danken den Mitarbeitern des Boisbonne Centre (Oniris Nantes, Frankreich) und der APEX-Plattform (Center of Excellence Nikon Nantes, gekennzeichnet mit IBISA und Biogenouest) am INRAE/Oniris PAnTher UMR 0703 (Oniris, Nantes, Frankreich) für ihr bemerkenswertes Engagement im Tierbereich Betreuung bzw. technischer Support. Die Autoren danken außerdem Biogenouest (Western France Life Science and Environment Core Facility Network, unterstützt vom „Conseil Régional des Pays de la Loire“) und NeurATRIS (Translational Research Infrastructure for Biotherapies and Neurosciences) für ihre kontinuierliche Unterstützung der APEX-Plattform . Die Autoren danken den Mitarbeitern des Synchrotron SOLEIL für ihre Unterstützung bei der Nutzung der DISCO-Beamline (Vorschlag 20170283).

ND wurde durch ein Master-2-Stipendium finanziert, das von Oniris und IMT Atlantic (Frankreich) vergeben wurde. RF und JP wurden von „La Région Pays de la Loire“ über Biogenouest finanziert. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des „Fonds Européen de Développement Régional“ (FEDER; Nr. PL0003686) unterstützt. Es wurde im Rahmen des IHU-CESTI-Projekts durchgeführt, das finanzielle Unterstützung der französischen Regierung erhielt, verwaltet von der ANR (Agence Nationale de la Recherche), durch die Investition in das zukünftige Programm ANR-10-IBHU-005. Das IHU-CESTI-Projekt wurde auch durch Zuschüsse von „La Région Pays de la Loire“ und „Nantes Métropole“ unterstützt. Synchrotron SOLEIL leistete seinen Beitrag durch die Bereitstellung des Zugangs zu Synchrotronstrahlungsanlagen.

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Laurence Dubreil, John Puentes und Karl Rouger

Oniris, INRAE, PAnTher, 44300, Nantes, Frankreich

Laurence Dubreil, Noreddine Damane, Romain Fleurisson, Marine Charrier, Julien Pichon, Isabelle Leroux, Cindy Schleder, Mireille Ledevin, Thibaut Larcher und Karl Rouger

IMT Atlantique, Lab-STICC, UMR CNRS 6285, 29238, Brest, Frankreich

Noreddine Damane & John Bridges

Synchrotron SOLEIL, BP48, L'Orme Des Merisiers, 91120, Gif-Sur-Yvette, Frankreich

Frederic Jamme

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LD und KR haben die Studie entworfen. ND und JP führten Bildanalysen von Weitfeld-DUV-Mikroskopieexperimenten durch. LD, RF, M.Ch., FJ, KR führten die Datenerfassung an der DISCO-Strahllinie durch. JP führte eine Immunfluoreszenz-Bildanalyse durch. IL und CS isolierten die MuStem-Zellchargen und bereiteten die Zellsuspensionen für die Transplantation vor. LD und FJ führten Bildanalysen von DUV-Mikrospektroskopie-Experimenten durch. ML führte Gewebeentnahmen und Immunhistochemie durch. TL führte die klinische Nachuntersuchung der Hunde durch, opferte die Tiere, beteiligte sich an der Gewebeentnahme und stellte histopathologisches Fachwissen zur Verfügung. KR und TL führten das In-vivo-Protokoll durch. LD, JP und KR sammelten und/oder stellten die Daten zusammen und beteiligten sich an der Datenanalyse und -interpretation. LD, JP und KR haben das Manuskript geschrieben und sind die Garanten dieser Studie. LD, JP und KR haben vollen Zugriff auf alle Studiendaten und übernehmen die Verantwortung für die Datenintegrität. FJ hat das Manuskript überarbeitet. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Laurence Dubreil oder Karl Rouger.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Dubreil, L., Damane, N., Fleurisson, R. et al. Spezifische und markierungsfreie endogene Signatur dystrophischer Muskeln durch tiefe ultraviolette Synchrotronstrahlung. Sci Rep 13, 10808 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37762-1

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Eingegangen: 3. April 2023

Angenommen: 27. Juni 2023

Veröffentlicht: 04. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37762-1

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