Mikrofluidische Studie in einem Messgerät

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 19553 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die mikrobiell induzierte Fällung von Kalziumkarbonat (CaCO3) (MICP) ist eine der wichtigsten nachhaltigen Alternativen zur künstlichen Zementierung körniger Medien. MICP besteht darin, den Boden nacheinander mit bakterien- und kalziumreichen Lösungen zu injizieren, um Calcitbindungen zwischen den Bodenpartikeln zu bilden, die die Festigkeit und Steifigkeit des Bodens verbessern. Die Leistung von MICP wird durch die zugrunde liegenden mikroskaligen Prozesse des Bakterienwachstums, des reaktiven Transports gelöster Stoffe, der Reaktionsgeschwindigkeiten, der Kristallkeimbildung und des Kristallwachstums bestimmt. Der Einfluss der Heterogenität der Porenskala auf diese Prozesse während der MICP ist jedoch nicht genau verstanden. Dieser Artikel beleuchtet die Auswirkung der Heterogenität im Porenmaßstab auf die räumlich-zeitliche Entwicklung von MICP, die allgemeine Effizienz chemischer Reaktionen und die Permeabilitätsentwicklung durch die Kombination von zwei meterlangen Mikrofluidikgeräten mit identischen Abmessungen und Porosität mit homogenen und heterogenen porösen Netzwerken und Echtzeitüberwachung . Die beiden Chips erhielten dreifach eine MICP-Behandlung mit einem erzwungenen Fluss und den gleichen Anfangsbedingungen, während die Einlass- und Auslassdrücke regelmäßig überwacht wurden. In diesem Artikel wird ein umfassender Arbeitsablauf vorgeschlagen, der dazu bestimmt ist, Bakterien und Kristalle aus Zeitraffer-Mikroskopiedaten an mehreren Positionen entlang einer mikrofluidischen Nachbildung poröser Medien, die mit MICP behandelt wurden, zu erkennen. CaCO3-Kristalle bildeten sich 1 Stunde nach dem Einbringen der Zementierungslösung (CS) und das Kristallwachstum war 12 Stunden später abgeschlossen. Die durchschnittliche Kristallwachstumsrate war im heterogenen porösen Medium insgesamt höher, während sie nach den ersten 3 Stunden der Zementierungsinjektion langsamer wurde. Es wurde festgestellt, dass die durchschnittliche chemische Reaktionseffizienz in der Mitte des Chips einen Spitzenwert von 34 % aufwies und vor den letzten 90 mm des Reaktionswegs für das heterogene poröse Netzwerk über 20 % blieb. Das homogene poröse Medium wies eine insgesamt geringere durchschnittliche Reaktionseffizienz auf, die 420 mm stromabwärts des Einlasses ihren Höhepunkt bei 27 % erreichte und für den Rest des Mikrofluidikkanals unter 12 % blieb. Diese unterschiedlichen Trends der chemischen Effizienz in den beiden Netzwerken sind auf eine höhere Anzahl von Kristallen mit höherem durchschnittlichen Durchmesser im heterogenen Medium als im homogenen porösen Medium zurückzuführen. Im Intervall zwischen 480 und 900 mm beträgt die Anzahl der Kristalle im heterogenen porösen Medium mehr als das Doppelte der Anzahl der Kristalle im homogenen porösen Medium. Die durchschnittlichen Durchmesser der Kristalle betrugen 23–46 μm im heterogenen porösen Medium, verglichen mit 17–40 μm im homogenen porösen Medium über den gesamten Chip. Die Permeabilität des heterogenen porösen Mediums wurde stärker beeinflusst als die des homogenen Systems, während die Drucksensoren effektiv einen stärkeren Rückgang der Permeabilität während der ersten zwei Stunden, als sich Kristalle bildeten, und einen weniger deutlichen Rückgang während des anschließenden Impfwachstums erfassten bestehende Kristalle sowie die Keimbildung und das Wachstum neuer Kristalle.

Im letzten Jahrzehnt hat sich die mikrobiell induzierte Calciumcarbonat (CaCO3)-Fällung (MICP) als nachhaltige Alternative zur herkömmlichen Bodenstabilisierung auf Basis von gewöhnlichem Portlandzement herausgestellt1. MICP wurde für eine Vielzahl potenzieller technischer Anwendungen untersucht, beispielsweise zur Bodenverbesserung zur Erhöhung der Steifigkeit und Festigkeit2,3,4 von körnigen Böden, allgemein als Bioinjektion5 bezeichnet; Immobilisierung von Schwermetallen und Radionukliden6; CO2-Sequestrierung7 und Versiegelung von Brüchen in CO2-Sequestrierungsbohrlöchern zur Minderung von Leckagen8. Die auf Ureolyse basierende MICP, der am besten untersuchte Mechanismus, erfolgt in zwei Phasen. In der ersten Stufe katalysieren ureolytische Bodenmikroorganismen, also Bakterien, die das Enzym Urease absondern, die Harnstoffhydrolyse (Gl. 1). Bei dieser Reaktion entstehen Ammoniumionen (NH4+), die den pH-Wert der Mikroumgebung erhöhen, sowie Carbonationen (CO32–). Folglich begünstigt die Alkalität die CaCO3-Ausfällung in Gegenwart ausreichender Calciumionen (Gleichung 2):

Der in Studien zu MICP durch Ureolyse am häufigsten verwendete Mikroorganismus ist Sporosarcina pasteurii (S. pasteurii) (Stammbezeichnung ATCC 11859), da es sich um einen nicht pathogenen Stamm handelt, der eine höhere Ureaseaktivität als viele andere Stämme gezeigt hat9. Sporosarcina pasteurii gehört zur Gattung Bacillus, die sich als grampositives Bakterium auszeichnet, das Endosporen bildet und aerob ist10. Die Zellen verfügen über ein negatives Zetapotential, das Kalziumionen anzieht und so eine heterogene Keimbildung begünstigt11. Unter heterogener oder geimpfter Keimbildung versteht man die Ausfällung auf Oberflächen wie Zellen, Gasblasen12 und Mineralien13,14, wodurch die für die Keimbildung erforderlichen Energiebarrieren verringert und die Keimbildungsrate erhöht werden. Im Gegensatz dazu bezieht sich die homogene Keimbildung auf die CaCO3-Ausfällung aus Kristallisationslösungen. Daher kann der Fällungsmechanismus bei MICP auf zwei verschiedene Arten induziert werden: (i) durch Bakterien, die als Keimbildungsstellen fungieren, d. h. über epizelluläre Fällung, und (ii) durch den Anstieg des pH-Werts um die ureolytischen Zellen aufgrund des oben genannten Harnstoffs Hydrolysereaktion15.

Das ausgefällte CaCO3 füllt die Porenräume körniger Medien und verleiht ihnen, was am wichtigsten ist, echten Zusammenhalt, indem es die Bodenkörner überbrückt, was letztendlich zu einer erhöhten Scherfestigkeit und Steifigkeit führt2. CaCO3-Niederschläge verringern die Porosität und Durchlässigkeit von Böden. Die Permeabilitätsabnahme aufgrund der MICP-Behandlung beträgt in den meisten Fällen weniger als 1 bis 3 Größenordnungen, was einen Vorteil von MICP im Vergleich zu chemischen Fugenmörteln darstellt, die die Permeabilität um bis zu 8 Größenordnungen reduzieren können16.

Die gleichmäßige Abgabe von Reaktanten über Entfernungen ist wichtig für die Sanierung großer Zielzonen bei der Feldanwendung von MICP17,18. Eine höhere Niederschlagsrate kann zu Verstopfungen in der Nähe der Einspritzstelle führen, während mit einer geringeren Niederschlagsrate eine höhere Gleichmäßigkeit erreicht werden kann. Unterschiedliche chemische Konzentrationen von Harnstoff und Calciumchlorid in der Zementierungslösung (CS) beeinflussen die Niederschlagsrate und -muster und verursachen Heterogenitäten im Mikromaßstab. Die Größe, Form und räumliche Verteilung des ausgefällten CaCO3 im Porenraum kann zu Unterschieden in der makroskaligen Durchlässigkeit und Festigkeit der biozementierten Böden führen19. Al Qabany und Soga19 zeigten beispielsweise, dass sich bei hochkonzentriertem CS von 1 M Harnstoff-Kalziumchlorid19 größere Kristalle bildeten, die die Poren verstopften, was zu einem schnelleren Rückgang der Permeabilität und Niederschlagsinhomogenitäten führte. Ein weiterer Faktor, der die Niederschlagsrate beeinflusst, ist die Partikelgröße und -abstufung des Bodens17. Die CaCO3-Fällung ist bei Partikelkontakten effektiver17. Mortensen et al. 17 berichteten über eine höhere Niederschlagsrate in dichten, gut sortierten und gröberen Sanden als in lockeren, feineren und schlecht sortierten Böden, was hauptsächlich auf die intrinsischen Eigenschaften des dem MICP unterworfenen Grundmaterials zurückgeführt wurde.

Die chemische Reaktionseffizienz, die als Prozentsatz des injizierten Kalziums und Harnstoffs definiert ist, der in CaCO3 umgewandelt wird, ist ein wichtiger Parameter, der während der Anwendung von MICP im Feldmaßstab kontrolliert werden muss, um die Verschwendung von Rohstoffen zu vermeiden20. Al Qabany et al.21 untersuchten die Faktoren, die die Effizienz auf Säulenebene beeinflussen, wie etwa die chemische Konzentration im CS, die Behandlungsdauer und die effektive Zufuhrrate, die als Verhältnis der chemischen Konzentration zum No-Flow definiert wurde Reaktionszeit (Retentionszeit). Es wurde festgestellt, dass bei einer OD600 von 0,8–1,2 die effektive Zufuhrrate von 0,042 mol/L/h zu einer Reaktionseffizienz von über 80 % für alle Sandproben führte, unabhängig von der verwendeten chemischen Konzentration (0,25–0,5–1 M Harnstoff). -Calciumchlorid). Zeng et al.22 berichteten von einer sehr geringen chemischen Effizienz von 5 % in einem Feldexperiment, was auf bevorzugte Fließwege zurückgeführt wurde, die die Reaktanten zu bestimmten Zonen der Bodenmatrix (Sandlinsen) leiten.

Traditionell werden biozementierte Proben mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) untersucht, was eine destruktive Probenahme nach der Behandlung erfordert, um detaillierte qualitative Informationen über die Struktur und Textur der biozementierten Böden zu liefern23. In den letzten Jahren wurden experimentelle Aufbauten entwickelt, die Mikrofluidik und Bildgebung kombinieren, um mikroskalige Prozesse von MICP23,24,25,26,27,28,29 und enzymatisch induzierter Calcitpräzipitation (EICP)30,31 in Echtzeit zu untersuchen. Mikrofluidische Geräte integrieren poröse Netzwerke (bekannt als Lab-on-a-Chip) und erleichtern die Bildgebung und Verfolgung. Aufgrund ihrer Transparenz und geringen Dicke ermöglichen sie die Visualisierung von Transportprozessen im Mikromaßstab und werden häufig für Anwendungen in der biomedizinischen Forschung32, der Wasserüberwachungsforschung33, dem Transport von Bakterien in porösen Medien34 und der verbesserten Ölgewinnung35 verwendet. Eine weitere Technologie, die zur Untersuchung der Keimbildung und des Wachstums von Einkristallen eingesetzt wird, ist die Tröpfchenmikrofluidik36. Mit diesem Aufbau konnten die Autoren die Einkapselung von Zellen durch Kristalle untersuchen, die für die Verfügbarkeit aktiver Zellen für die Fortsetzung der Ureolyse von entscheidender Bedeutung ist. Unter Berücksichtigung des oben Gesagten ermöglicht die Verwendung eines Lab-on-a-Chip für MICP-Studien eine Reihe von Echtzeitbeobachtungen, einschließlich (i) Quantifizierung von Bakterien, (ii) Quantifizierung von CaCO3-Kristallen und (iii) Bestimmung ihrer Formen.

Xiao et al.27 verwendeten einen Y-förmigen mikrofluidischen Chip aus Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS) mit zwei Einlassöffnungen für die gleichzeitige Injektion der Bakteriensuspension (BS) und CS, die zu einem homogenen mikrofluidischen Porennetzwerk-Reaktionskanal zusammenliefen . Die Bilder, die in einer Fläche von 2,8 mm x 4,5 mm (BxL) des Chips aufgenommen wurden, zeigten, dass CaCO3 zuerst an der Seite der BS-Injektion und dann an der Seite der CS-Injektion ausfiel. Darüber hinaus wurde in der Studie von Xiao et al.29 der Einfluss unterschiedlicher Calciumchloridkonzentrationen auf die Diffusion und Mobilität von Bakterien, die Kristallwachstumskinetik und die Kristallverteilung in MICP untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Konzentration von 0,5 M die Mobilität der Bakterien verringerte und sie auf die Seite der BS-Injektion beschränkte. Andererseits wurde bei einer Konzentration von 0,01 M am Ende der MICP-Behandlung eine homogenere Verteilung der Bakterien über die gesamte Breite des Chips erreicht, was auch zu einer homogeneren Verteilung der Kristalle führte.

Wang et al.24,25,26,28 verwendeten eine PDMS-Mikrofluidik mit Abmessungen von 15 mm x 15 mm, die auf der Grundlage der Querschnittsbilder eines verfestigten und geschnittenen 3D-Ottawa 30–50-Sandbodens entworfen wurde. Wang et al.26 zeigten, dass eine höhere Bakteriendichte zu einer insgesamt höheren Anzahl von Kristallen und einer schnelleren Kristallwachstumsrate führte. Genauer gesagt ergab die höchste Bakteriendichte (~5,2 × 108 Zellen/ml) 2 × 107 Kristalle/ml mit einem durchschnittlichen Kristallvolumen von 450 μm3, während die niedrigste Bakteriendichte (~0,6 × 108 Zellen/ml) ein niedrigeres ergab Menge an Kristallen (1,1 × 106 Kristalle/ml), aber ein höheres Durchschnittsvolumen von 8000 μm3. Das Kristallwachstum war nach 1,5 Stunden abgeschlossen, als die Bakteriendichte 5,2 × 108 Zellen/ml betrug, während eine zehnmal niedrigere Bakterienkonzentration zu einem Kristallwachstum von 15 Stunden führte. Wang et al.28 unternahmen den ersten veröffentlichten Versuch, die Ergebnisse mikrofluidischer Experimente zur Optimierung der Säulenexperimente zu nutzen. Genauer gesagt lieferten die mikrofluidischen Experimente Informationen über die Größe und Anzahl der Kristalle für niedrige (3–5 h) und hohe (24 h) Injektionsintervalle, die auch in den Säulenexperimenten beobachtet wurden und für die Prozesseffizienz von MICP und dem entscheidend waren mechanische Festigkeit der behandelten Böden.

Kim et al.30 verwendeten ein homogenes mikrofluidisches Glasgerät mit Abmessungen von 21,3 mm x 12,7 mm und untersuchten die Ausfällungskinetik für eine Mehrzyklusbehandlung mit EICP. Ein umfassender Bildanalysealgorithmus zur Segmentierung der Porenstruktur und des ausgefällten CaCO3. Nach unserem besten Wissen ist die Arbeit von Kim et al.30 die erste, die die beobachtete Keimbildungsrate während des Experiments im Mikromodell, das die nicht gut gemischten Bedingungen in einem homogenen porösen Medium simuliert, mit der vorhergesagten Keimbildung vergleicht Rate basierend auf der klassischen Nukleationstheorie. Da die Mikrofluidik nur eine 2D-Bildgebung ermöglicht, mussten Annahmen über die Form der Kristalle (sphärisch und halbkugelförmig) getroffen werden, um das Kristallwachstum in drei Dimensionen beurteilen zu können. Weinhardt et al.31,37 präsentierten einen Versuchsaufbau für die robuste Messung des Drucks in PDMS-Mikrofluidikkanälen mit quasi 1D- und quasi 2D-Porenstrukturgeometrien und wenigen mm Länge während der CaCO3-Fällung mittels EICP und beobachteten den Einfluss der Geometrie auf die Porosität-Permeabilität Beziehung. Mithilfe der Röntgenmikrocomputertomographie (XRCT), die die dritte Dimension der CaCO3-Ausfällungen nach dem Ende der EICP-Behandlung auflöst, wurde vorgeschlagen, dass die Kugel- und Kegelformen verwendet werden können, um das Volumen des ausgefällten CaCO3 aus 2D-Projektionen zu berechnen.

Obwohl die oben genannten Studien eine Vielzahl von Injektionsstrategien von BS und CS mit unterschiedlichen Injektionsintervallen, Bakteriendichten und Konzentrationen von CS in mikrofluidischen Domänen unterschiedlicher Geometrie in Echtzeit visualisiert haben, sind sie auf eine Fläche von einigen mm2 beschränkt. Allerdings handelt es sich bei MICP um ein reaktives Transportphänomen, bei dem Reaktanten in einer Entfernung vom Injektionspunkt verbraucht werden und die Geschwindigkeit der Bakterienablösung mit der Entfernung unterschiedlich sein kann. Darüber hinaus wird erwartet, dass die Heterogenität der Porenskala die räumliche Verteilung der Reaktanten aufgrund von Zonen höherer Geschwindigkeit beeinflusst, die Bakterien über eine längere Distanz übertragen können. Nach unserem besten Wissen wurde der Einfluss der Heterogenität im Porenmaßstab auf die chemische Reaktionseffizienz von MICP noch nicht untersucht.

Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Auswirkung der Heterogenität der Porenskala auf die chemische Reaktionseffizienz von MICP zu untersuchen. Es wurden zwei Arten von meterlangen Mikrofluidiken mit derselben anfänglichen Porosität hergestellt: homogene und heterogene Mikrofluidiken. Diese Arbeit stellt einen neuartigen Versuchsaufbau zur Bewertung der chemischen Reaktionseffizienz und zum Vergleich der Wirkung der produzierten ausgefällten CaCO3-Masse auf die Permeabilität homogener und heterogener poröser Medien vor. Die Ausfällung von CaCO3 wurde sowohl temporär als auch räumlich an verschiedenen Stellen entlang des meterlangen Weges überwacht und ermöglichte Einblicke in die Porenskala. Ein Bildverarbeitungsalgorithmus wurde entwickelt, um die experimentellen Bilder zu analysieren und die Anzahl der Bakterien sowie die Keimbildung und das Wachstum einzelner und agglomerierter ausgefällter Mineralien im Hinblick auf die Reaktionszeit und räumliche Verteilung zu erfassen. Basierend auf den verarbeiteten Bildern wurde eine umfassende statistische Analyse durchgeführt, um die Verteilung der Bakterien und Kristalle entlang des gesamten Chips über mehr als zehntausend Poren abzuschätzen und so unterschiedliche Niederschlagsmuster für die beiden Geometrien zu identifizieren.

Um den Effekt der Heterogenität im Porenmaßstab zu beurteilen, haben wir einen umfassenden Versuchsaufbau entwickelt (Abb. 1a), der ein sehr langes Mikrofluidikgerät verwendet, das mehrere Größenordnungen der durchschnittlichen Porengröße abdeckt und das wir auf einen Objektträger aus Mikroskopglas mit einer Größe von 75 mm passen 50 mm, wie in Abb. 1b, c dargestellt. Die gleiche Injektionsstrategie wurde dreifach auf zwei verschiedene mikroporöse Geometrien mit derselben Porosität (n = 0,5) angewendet: eine homogene (gleiche Porengröße über den gesamten Chip) und eine heterogene, dh mit räumlich variablen Abständen zwischen den Körnern. Die erste Geometrie bestand aus einem regelmäßigen Gitter identischer zylindrischer Feststoffkörner mit einer Porenhalsgröße (λ1) von 50 μm (Abb. 1b), während die zweite Geometrie aus unregelmäßig verteilten Feststoffkörnern mit Porenhalsgrößen im Bereich von 25 bestand bis 350 μm, mit einem Durchschnitt von λ2 = 70 μm (Abb. 1c)38. Diese künstlichen porösen Medien sind L = 990 mm lang, B = 3 mm breit und H = 0,050 mm dick, entsprechend L = 19800λ1, W = 60λ1 und H = λ1 für das homogene poröse Medium und L = 14143λ2, W = 43λ2 und H = 0,7λ2 für das heterogene poröse Medium.

(a) Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. Die Injektionsstrategie umfasst (1) die Injektion von Milli-Q-Wasser aus dem Auslass, (2) die Injektion von BS aus dem Auslass und (3) die Injektion von CS aus dem Einlass. PS1 und PS2 bezeichnen die am Einlass bzw. Auslass angeschlossenen Drucksensoren. Erstellt mit BioRender.com; (b) mikrofluidisches Design eines homogenen porösen Mediums; (c) Mikrofluidisches Design eines heterogenen porösen Mediums.

Die Mikrofluidik-Chips wurden mithilfe eines standardmäßigen Soft-Photolithographie-Verfahrens hergestellt. Das PDMS-Gerät wurde gemäß dem von Karadimitriou und Hassanizadeh39 beschriebenen Protokoll hergestellt. Die PDMS-Basis wurde gründlich mit dem Härter im Verhältnis 10:1 gemischt. Anschließend wurde die Mischung im Vakuum entgast, bevor sie in die Form gegossen und für mindestens 4 Stunden im Ofen bei 60 °C ausgehärtet wurde. Nach dem Entfernen des PDMS-Mikrofluidikkanals aus der Form wurden Ein- und Auslässe mit einem Durchmesser von 1,2 mm gestanzt. Sowohl der PDMS-Chip als auch eine Glasabdeckung wurden mit Plasma behandelt, wodurch die PDMS-Oberfläche hydrophil26 wie Sand wird. Anschließend wurde der Chip an der Glasabdeckung befestigt und für mindestens 30 Minuten auf eine Heizplatte bei 100 °C gelegt, um eine starke dauerhafte Verbindung zu gewährleisten. Anschließend wurde der Mikrofluidikchip in einen Exsikkator gegeben, um das PDMS etwa 30 Minuten lang zu entgasen, wodurch sichergestellt wird, dass alle vom PDMS während der Chipsättigung absorbierten Blasen entfernt werden. Als leicht gasdurchlässiges Material ermöglicht PDMS das aerobe Wachstum von S. pasteurii. Bei längerem Versuchsverlauf kann das Wasser jedoch verdunsten40. Daher wurde eine Injektionsstrategie so gewählt, dass die Experimente weniger als 24 Stunden liefen.

In der aktuellen Studie wurde flüssiges mikrobielles Wachstumsmedium (American Type Culture Collection (ATCC) 1376) verwendet, das aus 20 g/L Hefeextrakt, 10 g/L Ammoniumsulfat und 0,13 mol/L wässriger Tris-Pufferlösung mit einem anfänglichen pH-Wert bestand von 9, separat sterilisiert und dann gemischt, verwendet. Sporosarcina pasteurii, gelagert bei –80 °C, wurde in 4 ml frisches ATCC 1376-Wachstumsmedium inokuliert. Die Bakterienzellen wurden in einem Schüttelinkubator bei 180 U/min und 30 °C 48 Stunden lang gezüchtet, um stationäre Bedingungen zu erreichen. Die optische Dichte (OD) wurde mit einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD600) gemessen. Die in den Mikrofluidikstudien verwendete Bakteriensuspension (BS) wurde durch Verdünnen41 erhalten, um eine optische Dichte von 0,4–0,55 zu erreichen. Eine Zementierungslösung (CS) wurde durch Verdünnen äquimolarer Konzentrationen (1 mol/l) von Harnstoff (CH4N2O) mit einer Molarität von 60,06 g/mol und Calciumchlorid (CaCl2) (wasserfreies Sigma-Aldrich) mit einer Molarität von 110,98 g/mol hergestellt. mol in Milli-Q-Wasser.

Die Experimente wurden in einer gut kontrollierten Umgebung mit einer Temperatur von 25 ± 1 °C durchgeführt. Im Folgenden erläutern wir ausführlich die Injektionsstrategie, die aus drei aufeinanderfolgenden Injektionen besteht: (i) Sättigung des Chips mit MIlliQ-Wasser, (ii) Injektion von BS und (iii) Injektion von CS, wobei der Versuchsaufbau leicht modifiziert wird wie unten erläutert (Abb. 1a). Die Injektion von BS und CS über denselben Schlauch würde zur Vermischung der beiden Lösungen und anschließend zur Ureolyse und Ausfällung innerhalb des Schlauchs führen, der im Vergleich zum mikrofluidischen Aufbau einen größeren Querschnitt aufweist. Somit wäre der resultierende Niederschlag nicht repräsentativ für die räumliche Verteilung über die 1-m-Distanz. Daher wurden das verwendete Milli-Q-Wasser und die BS vom Auslass des Mikrofluidikkanals („Auslass“ in Abb. 1b, c) injiziert, während das CS vom Einlass („Einlass“ in Abb. 1b, c) injiziert wurde ). Hochpräzise Drucksensoren (Elveflow MPS-S-1 mit einem Arbeitsbereich von 340 mbar am Einlass und Elveflow MPS-S-0 mit einem Arbeitsbereich von 70 mbar am Auslass) wurden in Reihe zur Strömung in der Nähe von 7 cm platziert vom Einlass und 4 cm vom Auslass entfernt. Die Sensoren ermöglichten die Abschätzung der Druckdifferenz zwischen den beiden Punkten unter Strömungsbedingungen während der CS-Injektion sowie während der Retentions- und Niederschlagsphase ohne Durchfluss. Die Drucksensoren wurden mit Klebeband auf dem Mikroskoptisch befestigt und an einen Elveflow OB1-Druckregler42 angeschlossen. Der entgaste Mikrofluidikchip wurde horizontal auf dem Tisch platziert.

Tabelle 1 zeigt die Zusammensetzung von BS und CS sowie die ausgewählte Injektionsstrategie. Zur Sättigung des Mikrofluidikchips mit Milli-Q-Wasser wurde der Drucksensor in der Nähe des Auslasses mit dem Auslass und einer Glasspritze (Hamilton) mit Milli-Q-Wasser von 1–10 ml verbunden, die an einer Spritzenpumpe (Harvard Apparatus) montiert war ), während der Einlass zur Luft hin offen blieb. Für alle Verbindungen wurde Tygon-Schlauch 1/16″ verwendet. Der Chip wurde mit zwei Porenvolumina Milli-Q-Wasser bei einer Flussrate von 0,2 μL/s gesättigt. Am Ende der Injektion war am Einlass eine winzige Wasserblase zu beobachten, sodass keine Luft in den Mikrofluidikchip eindrang. Anschließend wurde eine Zeitspanne von 30 min bis zum nächsten Schritt eingehalten, damit die Gasblasen vom PDMS absorbiert wurden.

Nach der vollständigen Sättigung des Mikrofluidikchips wurde die BS aus dem Auslass injiziert. Zu diesem Zweck wurde die Spritze mit dem Milli-Q-Wasser durch eine Glas-Hamilton-Spritze mit 5 ml und BS ersetzt. Die Bakterieninjektion von 500 μl (ungefähr 7 Chip-Porenvolumina von 75 μl) dauerte 40 Minuten, um eine annähernd homogene Verteilung der Bakterien entlang des gesamten Chips zu erreichen.

Am Ende der Bakterieninjektionsphase, während sich die Zellen absetzten, wurden neunzehn Positionen entlang des Kanals für Beobachtungen ausgewählt. Dieser Schritt dauerte etwa eine Stunde und war notwendig, um die Positionen und den Fokus der 19 verschiedenen Standorte festzulegen. Während dieser Zeit wuchsen die Zellen von der anfänglichen OD600 von 0,40–0,55 vor der Injektion. Daher haben wir Bilder zum Zeitpunkt t = 0 aufgenommen, was dem Beginn der Zementierungsinjektion entspricht und die anfängliche Bakterienkonzentration darstellen kann. Um CS über den Einlass zu injizieren, wurde zunächst die mit dem Auslass verbundene Glasspritze vorsichtig entfernt und der Ausflussschlauch zur Abwassersammlung in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen gegeben. Das Falcon-Röhrchen enthielt 50 ml Milli-Q-Wasser und war sowohl während der Injektion als auch während der No-Flow-Bedingungen mit Parafilm und Aluminiumfolie abgedeckt, um eine Verdunstung zu verhindern bzw. einen gleichmäßigen Fluss bzw. No-Flow sicherzustellen. Die Harnstoffhydrolyse begann am Einlass, sobald der Schlauch mit dem CS an das bereits mit BS gesättigte Chip-Gerät angeschlossen wurde. Anschließend wurde eine 10-ml-Glas-Hamilton-Spritze auf die Spritzenpumpe montiert und über den Drucksensor mit dem Einlassschlauch verbunden (Abb. 1a). Vor dem Anschließen des Einlassschlauchs an den Kanal war dieser vollständig gesättigt, so dass am Rohrende ein Flüssigkeitstropfen erschien, um eine vollständige Sättigung beim Anschließen sicherzustellen. Die Zementinjektion wurde mit einer Durchflussrate von 0,018 μL/s durchgeführt, was einer Sickergeschwindigkeit von 0,24 mm/s entspricht, was der Sickergeschwindigkeit entspricht, die für eine im Labor vorbereitete Sandprobe mit einer Höhe von 10 cm und einem Durchmesser von 5 cm berechnet wurde und einer Porosität von 0,4, das mit einer Flussrate von 10 ml/min4 injiziert wurde. Die Retentionszeit von CS betrug 12–24 Stunden. Die angelegte Durchflussrate entspricht einer Reynolds-Zahl von \(Re = \frac{{\rho \overline{\lambda }\overline{u}}}{\mu } \ll 1\) (Tabelle S1), wobei \( \uprho\) ist die Wasserdichte (kg m−3), \(\overline{\lambda }\) ist die durchschnittliche Porenhalsgröße (m), \(\overline{u}\) ist die durchschnittliche Flüssigkeitsgeschwindigkeit ( ms−1) und \(\mu\) ist die dynamische Viskosität des Wassers (kg m−1 s−1). Daher kann die Strömung im Chip als Kriechströmung, auch Stokes-Strömung genannt, charakterisiert werden, die von viskosen Kräften dominiert wird. 6 Chip-Porenvolumina CS wurden 6,75 Stunden lang injiziert. In diesem Zeitraum wurden die Kristallkeimbildung und das Kristallwachstum unter Zufuhr frischer Lösung aufgefangen und während der Retentionszeit fortgesetzt. Zum Vergleich berichteten Xiao et al.29, dass ein einzelner Injektionsschritt aus 7 Chip-Porenvolumina bestand, während Kim et al.30 eine Behandlung mit 10 Zyklen implementierten, bei der jeder Zyklus aus etwa 100 Porenvolumina bestand und im Abstand von 48 Stunden wiederholt wurde. Allerdings handelt es sich bei diesen Arbeiten um viel kürzere Späne und die Injektion eines einzelnen Porenvolumens dauerte nur wenige Minuten.

Die Zeitrafferaufnahme wurde mit einem vollautomatischen, invertierten Nikon Eclipse Ti2-Mikroskop (Plan Fluor 10 × Phasenkontrastobjektiv) durchgeführt, das mit einer digitalen Farbkamera Nikon DS-Ri2 ausgestattet und von der NIS-Elements-Software gesteuert wurde. Große Bilder, bestehend aus 9 gekachelten Bildern mit einer Größe von 8813 Pixeln (2,57 mm in Querrichtung) mal 13.252 Pixeln (3,87 mm in Längsrichtung) und 3 × 3 Feldern, wurden an 19 Positionen entlang des Pfades aufgezeichnet (Abb. 2a). ) mit zwei verschiedenen Konfigurationen, Phasenkontrast (Abb. 2b) und Hellfeld (Abb. 2c). Zu den 19 untersuchten Positionen gehörten das Einlass- und Auslassloch, drei Positionen (links, in der Mitte, rechts) in der Nähe des Einlasses und Auslasses sowie in der Mitte jeder Reihe. Die Bilder wurden mit modifizierter Phasenkontrastmikroskopie aufgenommen (ein ph3-Ring kombiniert mit einem ph1-Objektiv, sodass die Beleuchtung fast seitlich erfolgt), was zu einem dunklen Hintergrund führte, wobei die Bakterien etwas heller waren und die Kristalle hell erscheinen. Im Gegensatz dazu erscheinen in den Bildern, die mit einer Hellfeld-Mikroskopiekonfiguration (ohne Kondensor) aufgenommen wurden, die Umrisse der Kristalle dunkel, während die Bakterien und der Hintergrund hell erscheinen. Die Belichtungszeit der Kamera wurde für die Phasenkontrast-Bildgebung auf 50 ms und für die Hellfeld-Bildgebung auf 2 ms eingestellt. Wir verwendeten eine hohe Auflösung von 0,29 μm/Pixel, um sowohl die Bakterien als auch die Kristalle zu beobachten. Wie oben erwähnt, wurden die Positionen während der Ansiedlung der Bakterien ausgewählt, während der Fokus auf einzelnen unbeweglichen Zellen lag, die sich auf der Unterseite des Chips (auf dem Glasobjektträger) befanden. Die Injektionsdauer eines CS-Porenvolumens betrug etwa 62 Minuten, während das Aufnahmesystem mit den beiden oben genannten optischen Konfigurationen 10 Minuten benötigte, um Bilder von Position 1 bis Position 19 zu sammeln. Um die Rechenzeit der großen, gesammelten Datenreihen zu optimieren, betrug das Zeitintervall der Bildaufnahme 1 Stunde während der Strömungsbedingungen und 2 Stunden während der Retentionsphase, da eine langsamere Wachstumsrate erwartet wurde. Daher wurde die zeitliche Entwicklung von MICP im Mikrofluidikchip in Echtzeit überwacht.

(a) Stichprobenpositionen; (b) Ausschnitt mit den Abmessungen 1,022 mm × 1,022 mm des grünen Kanals des mit Phasenkontrastmikroskopie aufgenommenen Originalbilds und (c) des grünen Kanals des mit Phasenkontrastmikroskopie aufgenommenen Originalbilds.

Wir haben einen umfassenden Bildverarbeitungsalgorithmus in MATLAB-Sprache entwickelt, um das ausgefällte CaCO3 und die Bakterien aus der kombinierten Verarbeitung der beiden Arten von Rohbildern (Phasenkontrast und Hellfeld) zu identifizieren.

Ein rohes experimentelles Bild ist ein 24-Bit-RGB-Farbbild, das aus drei Matrizen von 8813 × 13.252 besteht, von denen jede die Farben Rot, Grün und Blau darstellt. Jede Matrix enthält Werte im Bereich von 0 (schwarz) bis 255 (weiß). Die drei Kanäle wurden mithilfe der NIS Elements-Software separat als 8-Bit-Graustufenbilder extrahiert (Abb. S1, S2). Wir haben festgestellt, dass die Bakterienzellen im grünen Kanal die höchste Intensität aufweisen (Abb. S1), während die Kristalle auch im grünen Kanal die maximale Absorption aufweisen (Abb. S2). Daher wurden nur die grünen Kanäle der aufgenommenen Bilder weiterverarbeitet, um die Struktur des festen Mediums (die Körner), Bakterien und ausgefälltes CaCO3 zu segmentieren. Nach dem Anschließen der Schläuche am Einlass und der Injektion von CS bildeten sich in der Nähe des Einlasses große Bakterienaggregate, da sich positiv geladene Calciumionen an die negativ geladenen S. pasteurii-Zellen binden26 (Abb. S3). Die Intensität dieser Aggregate ähnelt der von ausgefälltem CaCO3; Daher wurden die Bilder, die am nächsten zum Einlass aufgenommen wurden (x = ~5 mm), nicht weiter verarbeitet.

Als erster Schritt wurden Bilder von jeder Position zu zwei verschiedenen Zeitpunkten ausgewählt: (i) zu Beginn der CS-Injektion (t = 0), wenn nur Bakterien beobachtet werden können, und (ii) nach dem Ende der CS-Injektion (t = 10 h), als sowohl Bakterien als auch Kristalle beobachtet werden konnten. Die Bilder wurden um 255 normalisiert, sodass jedes Pixel Werte zwischen 0 (dunkles Pixel) und 1 (helles Pixel) hatte. Nachfolgend erläutern wir den Arbeitsablauf zur Erkennung der drei Phasen: feste Körner, Bakterien und ausgefällte CaCO3-Mineralien.

Um die zylindrischen Vollkörner (dh den Kreis in unseren Bildern) aus dem bei t = 0 aufgenommenen Hellfeldbild (Abb. 3a) zu trennen, wurde das Bild mit der Funktion „Imbinarize“ in MATLAB binarisiert, die die Werte über einem adaptiven Schwellenwert ersetzt mit 1 (weiß) und die Werte unterhalb der Schwelle mit 0 (schwarz). Diese adaptive Schwellenwertmethode wählt einen Schwellenwert basierend auf der lokalen mittleren Intensität in der Nachbarschaft des Pixels aus. Um die Umrisse der Säulen zu erkennen, wurde die Option „ForegroundPolarity“ „dunkel“ verwendet, da deren Intensität geringer ist als die des Hintergrunds. Der Schwellenwert wurde durch den Parameter „Sensitivität“ bestimmt, der Werte von 0 bis 1 annehmen kann (siehe Zusatzmaterial). Durch die Verwendung einer höheren Empfindlichkeit werden mehr Pixel als Umrisse der Säulen definiert. Das resultierende Binärbild besteht aus dem Umfang der kreisförmigen Körner und Bakterien sowie dem Rauschen innerhalb der kreisförmigen Körner, dargestellt in Schwarz, und dem Porenraum sowie dem Inneren der kreisförmigen festen Körner, dargestellt in Weiß (Abb. 3b).

Arbeitsablauf, der die Extraktion binärer Bilder der Säulen aus den Hellfeldbildern bei t = 0 darstellt (a) Abschnitt mit den Abmessungen 1,022 mm × 1,022 mm des Rohbilds des grünen Kanals, (b) Bildbinarisierung, (c) Invertierung und Filterung von Lärm und Bakterien mit „bwpropfilt“, (d) Füllen der Säulen mit Weiß mit „imfill“.

Die Pixel, die Bakterien und Rauschen innerhalb der kreisförmigen Körner darstellten, wurden mithilfe der Funktion „bwpropfilt“ auf dem inversen Binärbild entfernt. Als Ergebnis entstand ein binäres Bild mit den Kreisen, die dem Umfang der Säulen in Weiß entsprechen, und dem Porenraum in Schwarz (Abb. 3c). Abschließend wurden die kreisförmigen Feststoffkörner mithilfe von „Imfill“ mit weißer Farbe gefüllt (Abb. 3d).

Die Bakterien wurden aus dem bei t = 0 aufgenommenen Phasenkontrastbild getrennt (Abb. 4a). Jedes Bild wurde mit „Imbinarize“ unter Verwendung der adaptiven Schwellenwertmethode binarisiert, wobei der Parameter „ForegroundPolarity“ auf die Option „Dunkel“ gesetzt wurde. Der Wert der „Empfindlichkeit“ wurde durch Versuch und Irrtum zwischen 0,1 und 0,2 definiert, um die Bakterien zu erkennen, da ihre Intensität etwas höher als der Hintergrund und viel niedriger als die Intensität des Umfangs von Säulen und Kristallen ist. Im resultierenden Binärbild werden die Bakterien und der Umfang der Säulen weiß dargestellt, während die Porenräume sowie das Innere der kreisförmigen Körner schwarz dargestellt werden (Abb. 4b). Anschließend setzen wir die Pixel, die den Säulen aus dem zuvor erfassten Binärbild in Abb. 3d entsprechen, auf Weiß (Abb. 4c). Schließlich trennten wir die Bakterien von den Säulen, indem wir die Partikel mit einer Fläche zwischen 10 und 900 Pixel2, entsprechend 2,9–261 μm2, wie mit dem Image Region Analyzer definiert, herausfilterten. Es wurde ein binäres Bild abgeleitet, in dem die Bakterien weiß auf schwarzem Hintergrund erschienen (Abb. 4d). Die Bakterien wiesen unterschiedliche Längen auf, da sie nach der Zellteilung wachsen (Abb. S4). Das gleiche Verfahren wurde angewendet, um die Bakterien bei t = 10 h (Abb. 4f – h) aus dem zu diesem Zeitpunkt aufgenommenen Phasenkontrastbild zu trennen (Abb. 4e).

Arbeitsablauf, der die Extraktion des Binärbilds von Bakterien aus dem Phasenkontrastbild bei t = 0 darstellt (a) Abschnitt mit den Abmessungen 1,022 mm × 1,022 mm des Rohbilds des grünen Kanals; (b) Bildbinarisierung, (c) Setzen Sie die Pixel, die den Säulen in Abb. 3d entsprechen, auf Weiß, (d) Entfernen Sie die Säulen mit „bwpropfilt“; bei t = 10 (e) Rohbild des grünen Kanals; (f) Bildbinarisierung, (g) Setzen Sie die Pixel, die den Säulen in Abb. 3d entsprechen, auf Weiß, (h) Entfernen Sie die Säulen mit „bwpropfilt“.

Anschließend wurde das ausgefällte CaCO3 aus dem bei t = 10 h aufgenommenen Hellfeldbild abgetrennt (Abb. 5a). Es wurde die adaptive Schwellenwertmethode verwendet, wobei der Parameter „ForegroundPolarity“ in der Option „Imbinarize“ auf „dark“ gesetzt wurde. „Empfindlichkeit“ wurde durch Versuch und Irrtum zwischen 0,4 und 0,5 definiert, um den Umfang des ausgefällten CaCO3 zu ermitteln. Im resultierenden Binärbild erschienen der Kristallumfang, die Säulen und einige Bakterien weiß, während die Porenflüssigkeit und das Innere der kreisförmigen Körner schwarz erschienen (Abb. 5b). Die MATLAB-Funktion „Imclose“ wurde verwendet, um die Kanten der Kristallumrisse zu glätten und eventuell vorhandene Löcher zu schließen (Abb. 5c). Dann haben wir die Funktion „imfill“ verwendet, um die Kristalle und Säulen mit Weiß zu füllen (Abb. 5d). Darüber hinaus wurden die Pixel, die den Säulen in Abb. 3d entsprechen, auf Null gesetzt. Dann wurde das Binärbild von Abb. 3d von diesem Binärbild subtrahiert, um die Säulen mit ihrem Umfang zu entfernen (Abb. 5e). Aufgrund von Änderungen der Beleuchtung während des Experiments blieben die Umrisse einiger Säulen erhalten und es waren zusätzliche Schritte erforderlich, um sie zu entfernen, damit sie nicht im Volumen des ausgefällten CaCO3 berücksichtigt wurden (siehe Zusatzmaterial). Die abgetrennte CaCO3-Phase ist in Abb. 5f dargestellt.

Arbeitsablauf, der die Extraktion des Binärbilds von Kristallen aus dem Hellfeldbild bei t = 10 h darstellt (a) Ausschnitt mit den Abmessungen 1,022 mm × 1,022 mm des Rohbilds des grünen Kanals; (b) Bildbinarisierung, (c) MATLAB-Funktion „Imclose“, um die Kanten der Umrisse von Kristallen zu glätten und alle vorhandenen Löcher zu schließen, (d) Funktion „imfill“, um die Kristalle und Säulen mit Weiß zu füllen (e) Legen Sie fest Pixel, die den Säulen in Abb. 3d entsprechen, in Schwarz, (f) Endergebnis der Kristallsegmentierung (g) Endergebnis des Bildverarbeitungsalgorithmus, der Porenflüssigkeit (weiß), feste Körner (schwarz) und Bakterien (cyan) segmentiert. bei t = 10 h.

Das vom Algorithmus erstellte endgültige verarbeitete Bild zeigt den Porenraum in Weiß (Pixelwert 0), die Bakterien in Cyan (Pixelwert 1), das CaCO3 in Rot (Pixelwert 2) und die Säulen in Schwarz (Pixelwert 2). von 3) (Abb. 5g). Mithilfe dieses Algorithmus können die kleinen Kristalle aufgrund der geringeren Intensität ihres Umfangs im grünen Kanal des Hellfeldbilds von den Bakterien gleicher Größe unterschieden werden.

Die bakterielle Oberflächenbedeckung wurde durch Berechnung der Pixelfläche (mit der MATLAB-Funktion „bwarea“) mit einem Wert von 1 im Binärbild der Bakterien geschätzt (Abb. 4d). Basierend auf der gemeldeten Größe von Sporosarcina pasteurii-Zellen von etwa 0,9–1,2 μm Breite mal 2–3,5 μm Länge und angesichts der Tatsache, dass sich Bakterien durch Zellteilung23 vermehren, haben wir für die folgenden Berechnungen angenommen, dass die Durchmesser eines einzelnen Bakteriums 4 μm Länge mal betragen 1 μm Breite. Um die Anzahl der Bakterien zu berechnen, haben wir die bakterielle Oberflächenbedeckung durch die durchschnittliche Größe eines einzelnen Bakteriums von 4 μm2 dividiert. Die Bakterienkonzentration wurde geschätzt, indem die Anzahl der Bakterien durch das Porenvolumen jedes Bildes dividiert wurde, wobei aufgrund der Stäbchenform von Sporosarcina pasteruii eine Breite von 1 μm in der 3. Dimension angenommen wurde43. Das Porenvolumen wurde geschätzt, indem das Kornvolumen vom Gesamtvolumen der beprobten Position abgezogen wurde. Das Kornvolumen in jeder abgetasteten Position wurde durch Berechnen der Fläche der Pixel mit einem Wert von 1 im Binärbild der Säulen (Abb. 3d) und Multiplizieren mit der Tiefe der Mikroflüssigkeit (50 μm) erhalten.

Unter der Annahme einer Kugelform der Kristalle30,37 wurde ihr äquivalenter Durchmesser D als Durchschnitt ihrer Neben- und Hauptachsen (einzeln oder aggregiert) definiert; somit ist ihr äquivalentes Volumen \(V_{cr,i} = \frac{4}{3}\pi \left( \frac{D}{2} \right)^{3}\). Die Gesamtmasse des ausgefällten CaCO3 an jeder Probenahmestelle wurde berechnet:

Dabei ist ρ = 2,71 g/cm3 die Dichte von Calcit und n die Anzahl der nachgewiesenen Mineralien (bei denen es sich sowohl um Einkristalle als auch um Kristallaggregate handeln kann).

Die chemische Reaktionseffizienz E von MICP ist definiert als das Verhältnis der gemessenen CaCO3-Masse zum theoretischen Maximalwert, als ob das gesamte lokal verfügbare Kalzium reagiert hätte, vorausgesetzt, dass Kalzium gleichmäßig entlang des Kanals verteilt ist. Daher ermöglicht der gewählte Aufbau, Licht auf spezifische Niederschlagsmuster zu werfen und Fragen zu beantworten wie: (i) Wird CaCO3 vorzugsweise in der Nähe des Einlasses abgelagert, wo Kalzium am meisten verfügbar ist? (ii) Beeinflusst die Heterogenität des Porennetzwerks die Ablagerung von CaCO3 über den reaktiven Pfad?

Die Calciumkonzentration im injizierten CS beträgt \(C_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} = c_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} M_{{{ \text{Ca}}^{2 + } }}\), wobei \(c_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} = 1\frac{{{\text{mol}}} }{L}\) ist die molare Konzentration von Kalzium und \(M_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} = 40,08\frac{{\text{g}}}{{\text{ L}}}\) ist die Molmasse von Kalzium. Somit ist \(C_{{{\text{Ca}}^{2 + } }} = 40,08\frac{{\text{g}}}{{\text{L}}}\).

Gemäß der Stöchiometrie in der chemischen Gl. (2) 1 Mol \({\text{Ca}}^{2 + }\) reagiert mit 1 Mol \({\text{CO}}_{3}^{ - 2}\) unter Bildung 1 mol CaCO3. Somit können 40,08 g/mol injiziertes \({\text{Ca}}^{2 + }\) theoretisch 100,09 g/mol CaCO3 bilden, wenn alles davon mit Carbonat reagiert, bevor es aus dem Mikrofluidikchip ausgespült wird.

Die theoretische Masse des ausgefällten CaCO3 beträgt:

wobei \(M_{{{\text{CaCO}}_{3} }} = 100,09\;{\text{g/mol}}\) die Molmasse von CaCO3 ist, \(Q\) die Durchflussrate und \({\Delta }t\) ist das Zeitintervall seit Beginn der CS-Injektion.

Die lokale chemische Effizienz an jeder Position wurde wie folgt berechnet:

wobei \(m_{{{\text{CaCO}}_{3} ,{\text{t }}}}^{{({\text{s}})}}\) die geschätzte Gesamtmasse des ist ausgefälltes CaCO3 an jeder Probenposition, berechnet nach (3), \(PV_{l}\) ist das Porenvolumen an der spezifischen Position und \(PV_{TOT} = 74\;\upmu {\text{L}}\ ) ist das Gesamtporenvolumen des Mikrofluidikkanals. Jede Position entspricht ungefähr 0,3 % von \(PV_{TOT}\). Am Ende der CS-Injektion beträgt die theoretische Masse des ausgefällten CaCO3 \(44,3\;{\text{mg}}\) im gesamten Chip, während sie an jeder Probenahmeposition je nach Ort 110–130 μg beträgt verfügbaren Porenraum.

Es wird angenommen, dass die Bakteriendichte die Wachstumsrate, Größe und Anzahl der CaCO3-Niederschläge beeinflusst26. Abbildung 6a zeigt die über die Dreifachmessungen gemittelte Bakterienkonzentration entlang des Chips zu Beginn der CS-Injektion (t = 0) (Abb. 6a) und bei t = 12 h (Abb. 6b). Bei t = 0 ist die durchschnittliche Bakterienkonzentration im homogenen Medium gleichmäßiger als im heterogenen porösen Medium bei 0–800 mm und liegt im Bereich von ~8 × 107 Zellen/ml bis 1,03 × 108 Zellen/ml im heterogenen porösen Medium , sinkt die Bakterienkonzentration von ~2 × 108 Zellen/ml auf 1 × 108 Zellen/ml in den ersten 400 mm und zeigt einen Spitzenwert bei 420 mm, bevor sie im Intervall 600 auf ~1–1,05 × 108 Zellen/ml abfällt –800 mm, wo sie etwa 50 % höher bleibt als die Konzentration im homogenen porösen Medium. In der Nähe des Auslasses wurde sowohl im homogenen als auch im heterogenen Mikrofluidiksystem eine geringere Bakterienkonzentration von ~3 × 107 Zellen/ml bis 4 × 107 Zellen/ml festgestellt.

(a) Bakterienkonzentration von S. pasteurii zu Beginn der CS-Injektion (t = 0); (b) bei t = 12 h über den meterlangen reaktiven Pfad. Punkte stellen Durchschnittswerte der Dreifachbestimmungen dar; Die schattierten Bereiche stellen die mittlere absolute Abweichung der Triplikate dar.

Während der CS-Injektion wurden Bakterien, die nicht an den Säulen oder dem Objektträger hafteten, transportiert oder in CaCO3-Kristallen eingekapselt (Abb. 7). Bei t = 12 h wurde eine etwas höhere durchschnittliche Bakterienkonzentration von ~3 × 107 Zellen/ml bis 7 × 107 Zellen/ml vom heterogenen porösen Medium zurückgehalten als vom homogenen Medium, wo eine durchschnittliche Konzentration von ~2,5 × 107 Zellen lag /ml bis 5 × 107 Zellen/ml wurde in 0–900 mm beobachtet, während in der Nähe des Auslasses die meisten Bakterien ausgespült wurden.

Das Wachstum von Einzelkristallen und Kristallaggregaten in ausgewählten Poren des homogenen Mikrofluidikchips wurde etwa 423 mm vom Einlass entfernt erfasst.

Bilder des Kristallwachstums in den ausgewählten Poren der homogenen und heterogenen Mikrofluidik-Chips sind in Abb. 7 bzw. Abb. 8 dargestellt. Die Kristallkeimbildung begann 1 Stunde nach Beginn der CS-Injektion sowohl im homogenen als auch im heterogenen porösen Medium. Abbildung 7 zeigt einzelne CaCO3-Kristalle, die 3 Stunden nach Beginn der CS-Injektion ~423 mm vom Einlass entfernt gebildet wurden. Sowohl auf den Säulen als auch auf dem Objektträger bildeten sich Kristalle, an denen die Bakterien haften blieben. Zunächst wiesen alle Kristalle eine Größe auf, die nicht groß genug war, um die angrenzenden festen Körner zu überbrücken. Bei t = 4 h bildeten sich fünf weitere Einkristalle (zwei sind unscharf), während die vorhandenen Kristalle größer wurden. Einer der Einkristalle wurde groß genug, um die beiden benachbarten Teilchen zu überbrücken. Zwei weitere Kristalle verschmolzen und bildeten ein Kristallaggregat, das auch zwei benachbarte feste Körner überbrückte. Bei t = 5 h wurden alle Kristalle größer. Allerdings wurde an dieser ausgewählten Position während der folgenden 1-stündigen und 40-minütigen Zeiträume kontinuierlicher CS-Injektion oder während des Zeitraums ohne Durchfluss bis t = 18 h kein weiteres Kristallwachstum beobachtet.

Entwicklung der Kristallaggregation im Porenraum zwischen drei zylindrischen Feststoffkörnern der heterogenen Nachbildung eines porösen Mediums. Diese Pore befindet sich an einer beprobten Stelle etwa 730 mm vom Einlass entfernt.

Abbildung 8 zeigt vier kleine einzelne CaCO3-Kristalle, die sich eine Stunde nach Beginn der CS-Injektion bildeten. Wie bei Wang et al.13 wuchsen einzelne nahe beieinander liegende Keimbildungspunkte getrennt, bis sie zu Kristallaggregaten (Mesokristallen2) verschmolzen. Hier fand der größte Teil des Wachstums innerhalb der ersten 4 Stunden statt, während es sich bis 18 Stunden mit sehr langsamer Geschwindigkeit fortsetzte. Dieser Trend lässt sich auch anhand der Diagramme des Massenkristallwachstums verifizieren (Abb. 9). Diese Abbildung zeigt das Wachstum der Kristallmasse an zwei Positionen: (a) in der Nähe des Einlasses und (b) in der Mitte der Mikroflüssigkeit. Es ist zu beobachten, dass das Wachstum im heterogenen porösen Medium insgesamt höher war. In beiden porösen Medien wurde das meiste Wachstum innerhalb der ersten 4 Stunden beobachtet. Im heterogenen porösen Medium war die Wachstumsrate in den folgenden 9 Stunden der MICP-Behandlung jedoch höher als im homogenen porösen Medium, das ein Plateau aufwies. Das Kristallwachstum war in den meisten Fällen 5 Stunden (t = 12 Stunden) nach dem Ende der 6 Stunden und 40 Minuten dauernden CS-Injektion abgeschlossen.

Kristallmassenwachstum während 12 Stunden MICP-Behandlung an zwei Positionen: (a) x = 30 mm und (b) x = 574 mm entlang des homogenen und heterogenen porösen Mediums. Punkte stellen Durchschnittswerte der Dreifachbestimmungen dar; Die schattierten Bereiche stellen die mittlere absolute Abweichung dar.

Die Verteilung des ausgefällten CaCO3 in Querrichtung der Strömung variiert von Position zu Position, wobei Kristalle die gesamte Ebene oder nahe den Grenzen einnehmen (Abb. S5). Dies kann auf die CaCO3-Ausfällung zurückgeführt werden, die den Fließweg oder bevorzugte Wege verändert, die die Reaktanten in Zonen bringen, in denen die Durchmischung verstärkt wird. Experimente mit Farbstoffen könnten jedoch weitere Einblicke in das Strömungsregime in den beiden Chips und deren Auswirkungen auf die Vermischung der Reaktanten im sich entwickelnden Porenraum liefern.

Die chemische Reaktionseffizienz wird in der vorliegenden Arbeit als der Prozentsatz des injizierten Kalziums definiert, der sich in CaCO3 umwandelt. Die geschätzte Masse des ausgefällten CaCO3 weist sowohl bei homogenen als auch bei heterogenen porösen Medien einen Peak in der Mitte des Mikrofluidikkanals auf (Abb. 10a). Abbildung 10b zeigt die geschätzte chemische Reaktionseffizienz in den homogenen und heterogenen porösen Medien. Sowohl die homogenen als auch die heterogenen porösen Medien weisen eine ungleichmäßige Reaktionseffizienz in Bezug auf den Abstand auf. Im homogenen porösen Medium ist der Wirkungsgrad in der Nähe des Einlasses gering und erreicht bei 420 mm mit durchschnittlich 22 % ein Maximum, während er zwischen 600 und 990 mm unter 11 % bleibt. Im Gegensatz dazu weist das heterogene poröse Medium einen Spitzenwert der Reaktionseffizienz von 37 % mit einer höheren Standardabweichung in der Mitte der Mikrofluidik auf und liefert Werte zwischen 15 und 28 % bei Abständen zwischen 500 und 900 mm vom Einlass. Dieser Befund geht außerdem mit einer geringeren Abweichung für das heterogene poröse Netzwerk einher, nachdem die Dreifachproben analysiert wurden. Wir gehen davon aus, dass die Diskrepanz zwischen den in der vorliegenden Studie gemessenen Effizienzwerten und den in der Literatur für Proben im Labormaßstab angegebenen Werten, typischerweise über 40 %2, auf die höhere Verfügbarkeit von Oberflächen in 3D-Säulenexperimenten zurückzuführen ist, bei denen die Korneigenschaften wie Rauheit44 oder Die Winkligkeit der Partikel und komplexere dreidimensionale Fließwege begünstigen die Zellanlagerung und die Calcitausfällung.

(a) Endmasse des ausgefällten CaCO3; (b) geschätzte Reaktionseffizienz am Ende der MICP-Behandlung (t = 12 h), als das Kristallwachstum abgeschlossen war. Punkte stellen die Durchschnittswerte der Dreifachversuche dar; Die schattierten Bereiche stellen die mittlere absolute Abweichung der Triplikate dar.

Basierend auf den obigen Erkenntnissen ist eine vorläufige Beobachtung, dass durch die Verwendung entgegengesetzter Enden für die Einführung von BS und CS die Biozementierung in der Mitte des Chips zunimmt und sich anschließend in Richtung des CS-Flusspfads entwickelt. Allerdings scheint die Architektur des Strömungsnetzwerks selbst diese Entwicklung im Hinblick auf die Reaktionseffizienz und die kristallinen Eigenschaften zu beeinflussen. Eine mögliche Erklärung ist, dass der vorherrschende CaCO3-Trend im homogenen porösen Netzwerk der von kleinen Einkristallen ist, die nicht ausreichend wachsen, um die Porenhälse zu verstopfen und schließlich weitere Reaktanten anzuziehen, was zu einer geringeren Effizienz führt. Bei der heterogenen porösen Architektur ist der Trend anders: Verschiedene Keimbildungspunkte wachsen zu größeren Aggregaten heran (Abb. 11), und die verstopften Porenhälse nehmen daher an Größe zu und beeinflussen dynamisch die Gewundenheit des Netzwerks.

(a) Durchschnittlicher Durchmesser der Kristalle. (b) Endgültige Kristallzahl bei t = 12 h. Punkte stellen die Durchschnittswerte der Dreifachversuche dar; Die schattierten Bereiche stellen die mittlere absolute Abweichung der Triplikate dar.

Diese charakteristischen Trends werden in Abb. 11a, b weiter veranschaulicht, wo die Anzahl und Größe der Kristalle für die beiden Chips variiert. Die Kristalle scheinen im heterogenen Medium (\(D_{eq}\) = 35–40 μm) größer zu sein als im homogenen Medium (\(D_{eq}\) = 28–35 μm) zwischen 600 und 800 mm und ergab eine größere mittlere absolute Abweichung in der zweiten Hälfte des Chips (Abb. 11a). Darüber hinaus wurde im heterogenen porösen Netzwerk zwischen 480 und 900 mm eine größere Anzahl von Kristallen (200–300 Kristalle) eingefangen, was eine höhere Calcitmasse und -effizienz im Vergleich zum homogenen Netzwerk (mit 60–100 Kristallen im gleichen Intervall) widerspiegelt. , wobei auf den ersten 200 mm eine geringere Biozementierung erfasst wurde.

Die Permeabilität der mikrofluidischen Kanäle wurde während der CS-Injektion gemessen. Durch Neuordnung des Darcy-Gesetzes für inkompressible Strömungen in Bezug auf die intrinsische Permeabilität k (m2) ergibt sich:

Dabei ist \(Q\) die vorgegebene Durchflussrate (m3/s), \(\mu\) die dynamische Wasserviskosität (N∙s/m), L (m) die Länge des Mikrofluidikkanals, A ( m2) ist die Querschnittsfläche (HxB), \(p_{1}\) (N/m2) ist der gemessene Druck am Einlass und \(p_{2}\) (N/m2) ist der gemessene Druck am Auslass.

Die CS-Injektion, bei der sich Kristalle bildeten und wuchsen, dauerte wie oben erwähnt 6 Stunden und 40 Minuten. Abbildung 12 zeigt die gemessene Druckdifferenz zwischen Einlass und Auslass während der CS-Injektion für die dritte Wiederholung des Experiments im homogenen und heterogenen porösen Medium. Die Rohdaten wurden mithilfe des Savitzky-Golay-Filters45 in Matlab geglättet, einer Moving-Window-Technik, die auf der lokalen Polynomanpassung der kleinsten Quadrate über den Zeitbereich basiert. Die Drucksensoren konnten den Anstieg der Druckdifferenz aufgrund der Verringerung der Porosität durch Kristallkeimbildung und -wachstum erfassen, der 4–5 Stunden später einen nahezu stabilen Zustand erreichte. Dies steht im Einklang mit dem beobachteten Trend hinsichtlich des Kristallwachstums sowohl qualitativ (Abb. 7, 8) als auch quantitativ (Abb. 9), dass der größte Teil des Kristallwachstums in den ersten 4–5 Stunden der CS-Injektion stattfindet. Abbildung 12 zeigt die abgeleitete Entwicklung der intrinsischen Permeabilität unter Verwendung von Gl. (6).

(a) Rohe und gefilterte Daten (mit dem Savitzky-Golay-Filter45) der Druckdifferenzentwicklung. (b) Berechnete intrinsische Permeabilitätsentwicklung während der CS-Injektion.

Nach dem Ende der CS-Injektion wurde eine Verringerung der Permeabilität des homogenen porösen Mediums um 16 % beobachtet, während die Verringerung beim heterogenen porösen Medium 22 % betrug. Der Unterschied in der Permeabilitätsreduzierung zwischen den beiden Chips beträgt nur 6 %, was bedeutet, dass der mikroskopische Unterschied in der Größe und Anzahl der Kristalle keinen überwiegenden Einfluss auf die makroskopische Permeabilität hat. Die geringe Permeabilitätsreduzierung zeigt, dass genügend alternative Strömungswege vorhanden sind, die nicht verstopft sind. Die Gesamtänderungen der Permeabilität bleiben im erwarteten Bereich von einer Größenordnung19. Die CaCO3-Ausfällung in engen Porenkehlen könnte die mechanische Festigkeit und Steifigkeit erhöhen25,46, im Gegensatz zur Ausfällung in offenen Porenkehlen, die die Permeabilität wirksam verringern könnte19,25.

Wir haben MICP in homogenen und heterogenen Chips in Echtzeit überwacht und visualisiert. In dieser Arbeit wurde ein neuartiger Versuchsaufbau zur Bewertung der Permeabilitätsänderungen während der MICP-Behandlung und zur Effizienzberechnung vorgestellt. Die Anzahl der Bakterien und die Masse der Niederschläge an verschiedenen Positionen entlang der Flugbahnen wurden quantifiziert, um die Calcitverteilung und Reaktionseffizienz auszudrücken und letztendlich die Wirkung der Porennetzwerke auf die Niederschlagsmuster zu bestimmen. Die Arbeit führte einen MATLAB-basierten Bildverarbeitungsworkflow ein, um die Handhabung großer Datenmengen zu erleichtern, die durch umfassende Bilderfassung entstehen. Zu den wichtigsten Schlussfolgerungen dieser Arbeit gehören die folgenden:

Bei einer kontinuierlichen Injektion von 6 Porenvolumina CS bildeten sich 1 Stunde nach Beginn der CS-Injektion CaCO3-Kristalle, die 12 Stunden später in beiden Mikrofluidikkanälen abgeschlossen waren.

Das Kristallwachstum in Bezug auf die produzierte CaCO3-Masse an verschiedenen Positionen entlang des Chips ist im heterogenen porösen Medium insgesamt höher, wenn man davon ausgeht, dass identische Behandlungsbedingungen angewendet wurden.

Durch die Verwendung entgegengesetzter Enden für die Einführung von BS und CS im heterogenen porösen Medium stieg die Biozementierung in der Mitte des Chips (420 mm) auf 34 % und entwickelte sich anschließend mit Werten über 20 % in Richtung des CS-Fließwegs, während in der In einem homogenen porösen Medium wurde 420 mm nach dem CS-Injektionspunkt ein Spitzenwert von 27 % erreicht, und die Reaktionseffizienz blieb im restlichen Mikrofluidikmedium um weniger als 12 % niedriger. Dies ist auf die beobachteten Trends einer höheren Anzahl von Kristallen zurückzuführen, deren Durchmesser trotz quasi identischer anfänglicher Bakterienverteilung für beide Medien zunimmt. Dies impliziert, dass die dynamische Entwicklung des reaktiven Strömungspfads eine Schlüsselquelle für das Verständnis der endgültigen Entwicklung der MICP-induzierten CaCO3-Ablagerung ist

Die oben genannten Ergebnisse werden nach dem Vergleich von Dreifachversuchen erfasst, bei denen die anfänglichen Behandlungsbedingungen (OD, Flussparameter, Injektionsaufbau) vor der Injektion in die homogenen und heterogenen Chips identisch waren. Im homogenen porösen Medium ist die Durchschnittsgeschwindigkeit gleichmäßig, was zu einer gleichmäßigen Bakterienverteilung führt. Im heterogenen porösen Medium, das aus Zonen höherer und niedrigerer Geschwindigkeit besteht, sammeln sich dagegen mehr Bakterien in der zweiten Hälfte des Chips an, was möglicherweise auch mehr verfügbare Keimbildungsstellen für die Kristalle bietet. Dies legt nahe, dass die intrinsischen Eigenschaften der porösen Materialien und die Architektur ihrer porösen Netzwerke das Schicksal der Ausfällung und die gewundenen Reaktionspfade beeinflussen. Unsere Studie wirft ein neues Licht auf die Entwicklung von MICP und seine Anpassung an das verfügbare Strömungsnetzwerk, indem sie technologische Fortschritte in der Mikroskopie, der Analyse großer Datenmengen und mikrofluidischen Geräten nutzt, Bereiche, von denen erwartet wird, dass sie innerhalb des traditionellen Bereichs der Geomechanik wachsen.

Der vorgeschlagene experimentelle Aufbau und das Bildanalyse-Framework können auf die Echtzeitüberwachung von MICP über mehrere Behandlungsmuster unter Verwendung unterschiedlicher Rezepturen unter Verwendung von Mikrovolumina erweitert werden.

Die für diese Studie verwendeten Datensätze und Codes werden nach der Veröffentlichung unter DOI verfügbar sein: https://doi.org/10.5281/zenodo.7319582.

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Diese Arbeit wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union gefördert (Grant Agreement No. 788587). Die Autoren möchten außerdem dem Environmental Fluid Mechanics Laboratory der Universität Lausanne (Unil), Dr. Stéphane Mahé für die Unterstützung der Bakterienkultivierung und Dr. Mayumi Hamada für die Mikrofertigung der meterlangen Mikrofluidikkanäle danken.

Labor für Bodenmechanik, EPFL, 1015, Lausanne, Schweiz

Ariadni Elmaloglou, Dimitrios Terzis & Lyesse Laloui

Labor für Umweltströmungsmechanik, UNIL, 1015, Lausanne, Schweiz

Pietro DeAnna

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AE führte die Laborexperimente durch. Die Autoren AE, DT und PdA trugen zur Gestaltung, Analyse und Interpretation der Laborexperimente bei. LL und DT haben die finanzielle Unterstützung für das Projekt eingeworben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Dimitrios Terzis.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Elmaloglou, A., Terzis, D., De Anna, P. et al. Mikrofluidikstudie in einem meterlangen reaktiven Pfad zeigt, wie die strukturelle Heterogenität des Mediums die MICP-induzierte Biozementierung beeinflusst. Sci Rep 12, 19553 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24124-6

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Eingegangen: 14. Juni 2022

Angenommen: 10. November 2022

Veröffentlicht: 15. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24124-6

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