Enge genetische Verknüpfung von Genen, die Hybridnekrose und Bestäuberisolation zwischen jungen Arten verursacht

Nature Plants Band 9, Seiten 420–432 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Mechanismen der reproduktiven Isolation, die zur phänotypischen Diversifizierung und schließlich zur Artbildung führen, sind ein Hauptthema der Evolutionsforschung. Hybridnekrose ist ein postzygotischer Isolationsmechanismus, bei dem sich der Zelltod in Abwesenheit von Krankheitserregern entwickelt. Dies ist häufig auf die Inkompatibilität zwischen Proteinen zweier Eltern zurückzuführen. Hier beschreiben wir einen einzigartigen Fall einer Hybridnekrose aufgrund einer Inkompatibilität zwischen Loci auf den Chromosomen 2 und 7 zwischen zwei von Bestäubern isolierten Petunienarten. In der nekrotischen Linie werden typische Immunreaktionen sowie Stressreaktionen des endoplasmatischen Retikulums induziert. Der Locus auf Chromosom 2 kodiert ChiA1, eine bifunktionale GH18-Chitinase/Lysozym. Die enzymatische Aktivität von ChiA1 ist für die Entstehung einer Nekrose entbehrlich. Wir schlagen vor, dass die extrem hohe Expression von ChiA1 eine positive Rückkopplungsschleife zwischen den Loci auf den Chromosomen 2 und 7 beinhaltet. ChiA1 ist eng mit wichtigen Genen verknüpft, die an der Anpassung an verschiedene Bestäuber beteiligt sind, einer Form der präzygotischen Isolation. Diese Verknüpfung prä- und postzygoter Barrieren stärkt die reproduktive Isolation und trägt wahrscheinlich zu einer schnellen Diversifizierung und Artbildung bei.

Die Artbildung hängt von der Entwicklung von Fortpflanzungsbarrieren ab, die den Genfluss zwischen sich zuvor kreuzenden Populationen verringern1,2,3. Bei Pflanzen stellt die durch Bestäuber vermittelte Isolierung eine entscheidende präzygotische Isolationsbarriere dar4. Die Präferenzen verschiedener Bestäuberklassen für Blütenmerkmale wie Farbe, Morphologie, Duft und Nektarproduktion gelten als treibende Kraft für die schnelle Diversifizierung der Angiospermen5. Diese übereinstimmenden Sätze von Blütenmerkmalen werden Bestäubungssyndrome genannt. Die Präferenz der Bestäuber für einen Blütentyp ist jedoch selten absolut und es wird häufig eine Hybridisierung zwischen (angehenden) Arten beobachtet. Daher beinhaltet die Artbildung von Pflanzen im Allgemeinen die Anhäufung mehrerer Fortpflanzungsbarrieren3.

Bei Pflanzen handelt es sich bei der Hybridnekrose (HN) um eine postzygotische Isolationsbarriere, bei der Hybriden nekrotische Blätter und schlechtes Wachstum aufweisen6,7. Viele der gemeldeten Fälle wurden durch schädliche epistatische Interaktionen zwischen Allelen an zwei oder mehr Orten verursacht, wodurch eine Barriere nach der Paarung entstand, die die Fitness der Hybriden, nicht jedoch der Eltern, verringerte8. Bei HN handelt es sich häufig um Gene, die Komponenten des Immunsystems kodieren9,10. Beispielsweise sind viele gemeldete Fälle von HN bei Arabidopsis auf falsche Kombinationen von Leucin-Rich-Repeat-Proteinen (NLR) in der Nukleotidbindungsdomäne zurückzuführen, die eine Schlüsselrolle im Immunsystem von Pflanzen und Wirbeltieren spielen11,12,13,14.

Wir haben zuvor die genetischen Grundlagen der Entwicklung von Bestäubungssyndromen in der südamerikanischen Gattung Petunia (Solanaceae) untersucht. Petunia axillaris (P. axillaris) ist im südlichen Südamerika weit verbreitet, während Petunia exserta (P. exserta) eine äußerst endemische Art ist, die ausschließlich in schattigen Schutzgebieten in der Guaritas-Region von Rio Grande do Sul, Brasilien, vorkommt15. P. axillaris hat weiße, UV-absorbierende, duftende Blüten und wird von Schwärmern bestäubt16,17, während P. exserta rote, geruchlose Blüten mit hervorstehenden Staubblättern und Narben aufweist und von Kolibris bestäubt wird15,18. Es wurde festgestellt, dass einzelne Gene, die den wichtigsten quantitativen Merkmalsstandorten (QTLs) für UV-Absorption (MYB-FL), Duftproduktion (CNL1) und Stempellänge (EOBII) zugrunde liegen, in einer sogenannten Supergenregion auf Chromosom 219,20,21 eng miteinander verbunden sind ,22. Es wird angenommen, dass eine solche enge genetische Verknüpfung die Auflösung von Bestäubungssyndromen durch Rekombination verhindert. Es wird angenommen, dass sich die beiden Arten kürzlich aus einem gemeinsamen Vorfahren entwickelt haben, der höchstwahrscheinlich von Schwärmern bestäubt wurde23,24,25. Natürliche Hybriden kommen an einigen Orten in der Guaritas-Region vor, wo die beiden Arten sympatrisch sind, was zeigt, dass die Fortpflanzungsbarrieren unvollständig sind18,25,26.

In diesem Artikel beschreiben wir einen Fall von HN bei einer Kreuzung zwischen P. axillaris und P. exserta. Die nekrotischen Symptome sind mit einer schädlichen Kombination zwischen zwei Loci auf Chromosom 2 und Chromosom 7 verbunden. Wir zeigen, dass der Locus auf Chromosom 2 ChiA1 kodiert, eine bifunktionale Chitinase/Lysozym mit einer wichtigen Rolle bei der mustergesteuerten Immunität gegen Pilze und Bakterien27. Wir diskutieren die potenzielle Relevanz der engen Verknüpfung von ChiA1 mit präzygotischen Isolationsbarrieren.

Die Introgressionslinie IL5 stammt aus einer Kreuzung zwischen dem von Schwärmern bestäubten P. axillaris N und dem von Kolibri bestäubten P. exserta28. Es trennt sich für eine P. axillaris-Region mit geringer Rekombination auf Chromosom 2 in einem ansonsten P. exserta-Hintergrund (Abb. 1a). In dieser sogenannten Supergenregion wurden zuvor mehrere wichtige Gene identifiziert, die die Merkmale des Bestäubungssyndroms beeinflussen19,20,21,22. Unerwarteterweise zeigten die Nachkommen von IL5, die in der Supergenregion homozygot für P. axillaris N sind (im Folgenden IL5-Ax genannt), nekrotische Symptome, die das Pflanzenwachstum (Abb. 1b) und die Blütenproduktion (Abb. 1c) stark beeinträchtigen. IL5-Ex-Pflanzen (homozygot für P. exserta in der Supergenregion) waren gesund. Die nekrotischen Symptome bei IL5-Ax können bereits 38 Tage nach der Aussaat beobachtet werden (Extended Data Abb. 1a). Die Symptome wurden auch bei Pflanzen beobachtet, die heterozygot für die Introgression waren (IL5-Het), waren jedoch milder als bei den IL5-Ax-Pflanzen, was auf eine Halbdominanz hindeutet (Abb. 1d). Nekrose war mit der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und einer erhöhten Expression wichtiger Gene im Zusammenhang mit der Pathogenese verbunden (Abb. 1e und erweiterte Daten Abb. 1b, c). Diese Daten stehen im Einklang mit HN, bei dem eine Immunantwort in Abwesenheit von Krankheitserregern ausgelöst wird10. Stressmarkergene des endoplasmatischen Retikulums (ER), z. B. zwei luminale Bindungsproteine ​​kodierende Gene BiP4 und BiP5 sowie der Transkriptionsfaktor bZIP60, wurden in der nekrotischen Linie stark induziert (Extended Data Abb. 1d), was auf einen durch ER-Stress induzierten Zelltod schließen lässt könnte eine Rolle bei der HN-Entwicklung spielen30.

a, Diagramm, das die Genotypen der homozygoten IL5-Versionen zeigt. Die gelbe Farbe zeigt die homozygote Region von P. axillaris N an, und die rote Farbe zeigt die homozygote Region von P. exserta an. Die sieben Chromosomen werden in der Reihenfolge von links nach rechts angezeigt. b, Bilder repräsentativer IL5-Ex- und IL5-Ax-Pflanzen 13 Wochen nach der Aussaat. c, Analyse der Blütenproduktion in IL5-Ex- und IL5-Ax-Pflanzen. Die Gesamtblütenzahl wurde für jeden Genotyp 6 Wochen nach der Entwicklung der ersten Blüte (ca. 10 Wochen nach der Aussaat) aufgezeichnet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt (n = 5 für IL5-Ax-Pflanzen; n = 6 für IL5-Ex-Pflanzen). ***P < 0,001; zweiseitiger Student-t-Test (P = 0,0002). d, Bilder repräsentativer IL5-Ex-, IL5-Het- und IL5-Ax-Pflanzen 10 Wochen nach der Aussaat. e, Bewertung der ROS-Produktion mittels DAB-Färbung einer repräsentativen 5 Wochen alten IL5-Ax-Pflanze. DAB wurde durch Wasserstoffperoxid (ROS) oxidiert und braun gefärbt. Das Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt (n = 3).

Quelldaten

HN resultiert oft aus Inkompatibilitäten zwischen genetischen Loci, die sich im Laufe der Zeit divergiert haben und in Hybriden zusammengeführt werden10. Solche Interaktionen können Paare nuklearer Gene oder nukleozytoplasmatische Interaktionen umfassen31,32. Daher haben wir reziproke F2-Populationen generiert, die von P. axillaris N und P. exserta abgeleitet sind, um die genetische Architektur von HN zu analysieren und die Loci zu identifizieren, die mit der Chromosom-2-Region interagieren. Beide Populationen zeigten vergleichbare Verteilungen der HN-Werte, das heißt, etwa drei Viertel der Pflanzen zeigten keine Symptome und ein Viertel der Pflanzen zeigte Symptome. Die ähnliche Verteilung der HN-Scores in den beiden Populationen weist darauf hin, dass die HN-kontrollierenden Loci nuklear sind, da die zytoplasmatische Vererbung unidirektional erfolgt (Abb. 2a, b). Zur Lokalisierung der genomischen Regionen, die HN verursachen, wurde Bulked Segregant RNA Sequencing (BSR-seq) eingesetzt. Auf den Chromosomen 2 und 7 wurden starke Signale im Zusammenhang mit dem nekrotischen Phänotyp festgestellt (Abb. 2c und erweiterte Daten Abb. 2). Wir haben diese Loci HNe2 und HNe7 genannt. Die Nekrose wird durch eine Kombination von P. axillaris N-Allelen bei HNe2 und P. exserta-Allelen bei HNe7 (Abb. 2c und Extended Data Abb. 2) entsprechend der genetischen Ausstattung von IL5-Ax (Abb. 1a) ausgelöst. .

a, Typischer Phänotyp der F2-Pflanzen 13 Wochen nach der Aussaat. Die Pflanzen wurden in gesunde oder nekrotische Gruppen eingeteilt. b, Verteilung der nach a qualitativ klassifizierten F2-Pflanzen. Insgesamt wurden 384 Pflanzen aus jeder der F2-Populationen phänotypisiert. Pax, P. axillaris N; Pex, P. exserta. c: QTL-Kartierung unter Verwendung der Bulked-Segregant-RNA-Seq-Methode, die Regionen mit übermäßigen Unterschieden in der Allelfrequenz zwischen dem Pool nekrotischer und dem Pool gesunder Individuen zeigt. Ein hoher Wert auf der Y-Achse zeigt an, dass viele der SNP-Positionen in einem Fenster einen Allelfrequenzunterschied außerhalb der genomweiten Quantilschwellenwerte aufweisen. Die Schwellenwerte liegen bei den genomweiten Quantilen 0,05 und 0,95 (braune Linie) und 0,01 und 0,99 (gelbe Linie). Stepping-Fenster umfassen 100 SNPs.

Um das HNe2-tragende Intervall zu reduzieren, wurde ein Feinkartierungsansatz durch die Suche nach rekombinanten Nachkommen von IL5-Het durchgeführt. Die Beziehung zwischen der phänotypischen Segregation von HN und dem Genotyp der rekombinanten Linien führte zu einem ersten Intervall von 8,7 Mb (Abb. 3a und Ergänzungstabelle 1). Anschließend wurden die Rekombinationsbruchpunkte von zehn der informativsten Linien durch Sequenzierung des gesamten Genoms genau charakterisiert, was zu einem 1,74-MB-Intervall führte (Abb. 3a und erweiterte Daten, Abb. 3). Da diese Region noch 60 Gene enthält (Ergänzungstabelle 2), wurde eine RNA-Sequenzierungsanalyse (RNA-seq) von Blattgeweben von IL5-Ax- und IL5-Ex-Pflanzen durchgeführt, um deren funktionelle Relevanz anhand der Expression zu untersuchen. Von den 34 exprimierten Genen in der Kandidatenregion (Lesezahlen > 100 in mindestens einer der Proben; Ergänzungstabelle 3) wurden 8 unterschiedlich exprimiert (q <0,001), darunter 4 Gene, von denen bekannt ist, dass sie bei Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Krankheitserregern eine Rolle spielen: ChiA1, ChiA2, FMO1 und CNGC1 (Tabelle 1 und Ergänzungstabelle 4).

a, Diagramm, das das kartenbasierte Klonen von HNe2 zeigt. Zunächst wurde der HNe2-Locus einer 8,7-MB-Region auf Chromosom 2 zugeordnet. Einzelheiten finden Sie in den Methoden und Ergänzungstabellen 1–4. b, c, VIGS der vier ausgewählten Kandidatengene für HNe2: repräsentative Blattphänotypen aus einem Zweig, die nach der ChiA1-VIGS-Behandlung und der leeren Kontroll-VIGS-Behandlung in IL5-Ax entstehen; Die Blätter sind von oben nach unten angeordnet. Maßstabsleiste, 1 cm (b). Gelbes Flächenverhältnis der IL5-Ax-Pflanzenblätter nach VIGS von ChiA1, ChiA2, FMO1, CNCG1 und leerer Kontrolle; Für jede Behandlung wurden fünf biologische Replikate verwendet (n = 5 Pflanzen). Die Symptome wurden anhand des Verhältnisses der gelb gefärbten Fläche zur gesamten Blattfläche quantifiziert. Ein höherer Wert weist auf einen höheren Anteil gelber Fläche hin. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin (P < 0,05, einfaktorielle ANOVA, Tukeys ehrlich signifikanter Differenztest (HSD)); Für P-Werte siehe Quelldaten (c). d,e, Vorübergehende Überexpression von ChiA1Ax in IL5-Ex-Pflanzenblättern: Ein repräsentativer Phänotyp von IL5-Ex-Blättern nach Agroinfiltration mit 35S::ChiA1Ax oder 35S::ChiA1Ex als Kontrolle; Maßstabsleiste, 1 cm (d). Gelbes Flächenverhältnis von IL5-Ex-Pflanzenblättern nach Agro-Infiltration von 35S::ChiA1Ax, 35S::ChiA1Ex, 35S::GFP und leerem Infiltrationspuffer. Für jede Behandlung wurden drei einzelne Pflanzen verwendet. Als Negativkontrollen wurden ChiA1Ex, GFP und Infiltrationspuffer verwendet. Der Phänotyp wurde 2 Wochen nach der Infiltration analysiert. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin (P < 0,05, einfaktorielle ANOVA, Tukey-HSD-Test); Für P-Werte siehe Quelldaten (e). f, Diagramm, das die vorhergesagten Proteinprodukte des ChiA1-Gens in IL5-Ax, IL5-Ex und chia1-cas9-1 zeigt. Das rote Kästchen zeigt die durch Frameshift verursachte nicht übereinstimmende Proteinsequenz an. Die Zahlen geben die Aminosäurestellen an. SP, Signalpeptid; GH18, Glykosylhydrolase-18-Domäne. g,h, Pflanzenphänotyp (g) und Blattgelbflächenverhältnis (h) von chia1-cas9-1 in IL5-Ax (Mitte) im Vergleich zu IL5-Ax (links) und IL5-Ex (rechts). Für das Blatt-Gelb-Flächenverhältnis wurden für jeden Genotyp drei einzelne Pflanzen analysiert. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin (P < 0,05, einfaktorielle ANOVA, Tukey-HSD-Test); Für P-Werte siehe Quelldaten.

Quelldaten

Chitinase A1 (ChiA1) ist eines der am stärksten exprimierten Gene in IL5-Ax (Tabelle 1 und erweiterte Daten, Abb. 4a) und wird als bifunktionale Endochitinase33 bezeichnet (erweiterte Daten, Abb. 4b). Das von ChiA1 kodierte Protein ist homolog zu AtLYS1/ChiA (AT5G24090), das eine zentrale Rolle bei der Auslösung von Immunantworten bei Arabidopsis27 spielt (Extended Data Abb. 4c). Wichtig ist, dass ChiA1 eine Nonsense-Mutation in P. exserta trägt, die zu einem verkürzten Protein von 158 Aminosäuren führt (Extended Data Abb. 4d, e). ChiA2 ist eng mit ChiA1 verwandt, zeigt jedoch in IL5-Ax ein viel geringeres Expressionsniveau als ChiA1 (Tabelle 1). Flavinhaltige Monooxygenase 1 (FMO1) spielt eine Schlüsselrolle bei der systemischen erworbenen Resistenz, indem sie N-OH-Pip aus Pipecolinsäure synthetisiert34. Im Genom von P. exserta gibt es zwei Kopien, während in P. axillaris N nur eine Kopie vorhanden war. Der zyklische Nukleotid-gesteuerte Ionenkanal 1 (CNGC1) gehört zu einer Genfamilie, die an der pflanzlichen Immunität beteiligt ist, indem sie Kalziumsignale und eine überempfindliche Reaktion auslöst35, 36.

Um diese vier Kandidaten für HNe2 funktionell zu validieren, haben wir ihre Transkriptmengen in IL5-Ax durch virusinduzierte Gen-Stummschaltung (VIGS) gesenkt37. VIGS von ChiA1 verursachten einen starken Rückgang der Nekrose in IL5-Ax-Pflanzen im Vergleich zum leeren Vektor oder zu unbehandelten Kontrollen (Abb. 3b, c). Im Gegensatz dazu zeigten VIGS von ChiA2, FMO1 und CNGC1 keine signifikante Verringerung der Symptome (Abb. 3c). Um die Rolle von ChiA1 in HN zu bestätigen, haben wir ChiA1Ax (P. axillaris N-Allel) sowie ChiA1Ex (P. exserta-Allel) in IL5-Ex-Blättern, gesteuert durch den 35S-Promotor, vorübergehend überexprimiert. ChiA1Ax war stark exprimiert, während ChiA1Ex kaum nachweisbar war (Extended Data Abb. 4f). Nur Blätter, die ChiA1Ax überexprimieren, verfärbten sich im Bereich der Infiltration gelb (Abb. 3d, e). Somit ist die fehlende Anreicherung von Boten-RNA posttranskriptionell bedingt, was höchstwahrscheinlich auf den Nonsense-Mediated Decay (NMD) zurückzuführen ist38. Darüber hinaus erzeugten wir eine ChiA1-Funktionsverlustmutante im IL5-Ax-Hintergrund durch geclusterte, regelmäßig beabstandete kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) – Cas9. Die Mutante (chia1-cas9-1) weist eine 4-bp-Deletion auf, die zu einem Frameshift und einem vorzeitigen Stoppcodon führt, was zu einem verkürzten Protein mit 173 Aminosäuren (anstelle der 292 Aminosäuren in voller Länge) führt, ähnlich dem kodierten Protein von ChiA1Ex (Abb. 3f). Die nekrotischen Symptome waren stark reduziert und die Pflanzenmorphologie ähnelte der von IL5-Ex (Abb. 3g, h und erweiterte Daten Abb. 5a, b). Die kombinierten Ergebnisse beweisen zweifelsfrei, dass ChiA1 das Gen ist, das HNe2 zugrunde liegt.

ChiA1 beherbergt die Glycosid-Hydrolase-18-Domäne (GH18) und ein Sekretionssignalpeptid (Extended Data Abb. 4b) und ist wahrscheinlich ein bifunktionelles Enzym, das sowohl Chitin als auch Peptidoglycan als homologe Proteine ​​in Gummibaum (Hevea brasiliensis) und Arabidopsis verdaut 27, 39. Wir beobachteten, dass die Chitinase- und Lysozymaktivitäten in IL5-Ax-Blättern im Vergleich zu den anderen Linien extrem hoch waren (Abb. 4a). In der chia1-cas9-1-Mutante waren diese Aktivitäten auf ein ähnliches Niveau wie in IL5-Ex reduziert. P. axillaris N-Pflanzen, die ChiA1 (35S::ChiA1) überexprimieren, zeigten höhere Aktivitätsniveaus im Vergleich zu Wildtyp-P. axillaris N-Pflanzen. Darüber hinaus stimmten die Enzymaktivitäten mit den Transkriptionsniveaus von ChiA1 überein (Abb. 4b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ChiA1 für die hohen Chitinase- und Lysozymaktivitäten in IL5-Ax-Blättern verantwortlich ist.

a, Chitinase- und Lysozymaktivität in Blattgeweben von IL5-Ax, chia1-cas9-1 (IL5-Ax), IL5-Ex, P. axillaris N und ChiA1-Überexpressionslinie im P. axillaris N-Hintergrund (35S::ChiA1Ax). Für jeden Genotyp wurden neun Pflanzen verwendet und für Replikate in drei Gruppen eingeteilt. Von jeder Gruppe wurden 66 Blattscheiben beprobt, um die insgesamt genutzte Blattfläche zu vereinheitlichen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Verschiedene Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede an (P < 0,05, einfaktorielle ANOVA, Tukeys ehrlich signifikanter Differenztest (HSD)); IL5-Ax wurde nicht in den ANOVA-Test einbezogen; Für P-Werte siehe Quelldaten. b: Quantitative RT-PCR, die die Transkription von ChiA1 in Blättern von 12 Wochen alten IL5-Ax, chia1-cas9-1 (IL5-Ax), IL5-Ex, P. axillaris N und der ChiA1-Überexpressionslinie in P. axillaris zeigt N (35S::ChiA1) Hintergrund. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten (n = 3) dargestellt. c, Repräsentative Blattphänotypen von IL5-Ax- und IL5-Ex-Pflanzen in steriler Kultur. Der Phänotyp der Blätter wurde 12 Wochen nach der Aussaat analysiert. Vier einzelne Pflanzen jedes Genotyps wurden mit ähnlichen Ergebnissen beobachtet. Maßstabsleiste, 1 cm. d, Analyse des Schweregrads der Nekrose von IL5-Ax- und IL5-Ex-Pflanzenblättern aus c. Das Gelbflächenverhältnis basiert auf dem Verhältnis der gelb gefärbten Fläche zur gesamten Blattfläche. Ein höherer Wert weist auf ein größeres Gelbflächenverhältnis hin. n = 15 Blätter für IL5-Ax und 16 Blätter für IL5-Ex. (**P < 0,01, zweiseitiger Student-t-Test, P = 0,0023). e, Repräsentativer Phänotyp von IL5-Ex-Blättern, die vorübergehend ChiA1D148A, E150A, ChiA1Ax, ChiA1Ex oder GFP überexprimieren. Für die Überexpression wurde der 35S-Promotor verwendet. Zur Agrarinfiltration wurden sieben Wochen alte IL5-Ex-Pflanzenblätter verwendet. Die Fotos wurden 2 Wochen nach der Infiltration aufgenommen. Es wurden drei biologische Replikate mit ähnlichen Ergebnissen verwendet (Extended Data Abb. 7b). Maßstabsleiste, 1 cm. Schematische Darstellungen der Proteinprodukte der ChiA1-Varianten sind im unteren Bereich dargestellt.

Quelldaten

Da ChiA1 mikrobielle Zellwandkomponenten abbaut, fragten wir, ob die nekrotischen Symptome möglicherweise durch konservierte Abbauprodukte mikrobieller Zellwände verursacht werden, die als mikrobenassoziierte molekulare Muster fungieren könnten. Unter axenischen Bedingungen entwickelten IL5-Ax-Pflanzen immer noch starke nekrotische Symptome (Abb. 4c, d; und erweiterte Daten Abb. 6). Dies deutet darauf hin, dass sich nekrotische Symptome entwickeln, wenn kein mikrobielles Substrat für ChiA1 vorhanden ist. Um zu testen, ob die Symptomentwicklung auf der enzymatischen Aktivität von ChiA1 beruht, haben wir eine ChiA1-Mutante erzeugt, in der die kritischen Aminosäuren D148 und E150 im DXDXE-Motiv des aktiven Zentrums der Glycosidhydrolase durch Alanin ersetzt sind (Abb. 4e). Die Mutation dieser beiden Aminosäuren hebt sowohl die Chitinase- als auch die Lysozymaktivität auf41,42,43 (Extended Data Abb. 7a). IL5-Ex-Blätter, die entweder das katalytisch inaktive ChiA1D148A, E150A oder ChiA1Ax überexprimierten, zeigten eine starke Nekrose an der Infiltrationsstelle, wohingegen die Überexpression von ChiA1Ex und GFP keine Symptome hervorrief (Abb. 4e und erweiterte Daten Abb. 7b, c). Diese Ergebnisse zeigen, dass die nekrotischen Symptome einen Fall von Autoimmunität darstellen, der nicht auf den enzymatischen Aktivitäten von ChiA1 beruht.

Die Neuprogrammierung der Transkription ist ein wesentlicher Bestandteil der pflanzlichen Immunität44. Um den Mechanismus, der der Aktivierung des Immunsystems in IL5-Ax zugrunde liegt, besser zu verstehen, haben wir die Promotoren der 1.717 differentiell exprimierten Gene (DEGs; q <0,001) zwischen IL5-Ax und IL5-Ex auf konservierte cis-Elemente untersucht (Ergänzungstabelle). 5). Eine WRKY-Bindungsstelle (Abb. 5a) war in 60 % der DEG-Promotoren vorhanden (Ergänzungstabelle 6). WRKY-Transkriptionsfaktoren sind an Pathogenreaktionen, Reaktionen auf abiotischen Stress und Seneszenz beteiligt45,46. Von allen DEGs, die für WRKY-Transkriptionsfaktoren kodieren, zeigte WRKY18 (homolog zu AtWRKY18) das höchste Expressionsniveau in IL5-Ax, während seine Expression in IL5-Ex- oder P. axillaris N-Wildtyp-Pflanzenblättern vernachlässigbar war (Abb. 5b). Darüber hinaus bindet AtWRKY18 an das typische Bindungsmotiv in seinen Zielgenen47 (Abb. 5a). Die Überexpression von WRKY18 induzierte nekrotische Symptome in Blättern von IL5-Ex sowie Nicotiana benthamiana (Abb. 5c, d). Wichtig ist, dass die Agro-Infiltration von 35S::ChiA1Ax, aber nicht von 35S::ChiA1Ex in IL5-Ex-Blättern die WRKY18-Expression induzierte (Abb. 5e und 3d und erweiterte Daten Abb. 4f). Wir kommen zu dem Schluss, dass die bei IL5-Ax beobachtete massive Neuprogrammierung der Transkription durch die ChiA1-abhängige Induktion, höchstwahrscheinlich indirekt, eines oder mehrerer Transkriptionsfaktoren vom Typ WRKY18 vermittelt wird.

a, Das konservierte cis-Element, das in den Promotoren der DEGs zwischen IL5-Ax- und IL5-Ex-Blattgeweben gefunden wird. Für die cis-Element-Analyse wurden ein Kilobasen große Promotorsequenzen stromaufwärts des Translationsstartcodons der 1717 DEGs verwendet. b: Quantitative RT-PCR, die die Transkriptionsniveaus von WRKY18 in P. axillaris N-, IL5-Ax-, IL5-Ex- und IL5-Het-Pflanzenblättern zeigt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten (n = 3) dargestellt. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin (P < 0,05, einfaktorielle ANOVA, Tukeys ehrlich signifikanter Differenztest (HSD)); Für P-Werte siehe Quelldaten. c, Repräsentative Bilder von IL5-Ex-Blättern 2 Wochen nach der Agrarinfiltration mit 35S::WRKY18, mit 35S::GFP als Kontrolle. Es wurden fünf biologische Replikate mit ähnlichem Phänotyp beobachtet. Die rechten Felder sind Nahaufnahmen der Regionen mit roten Rahmen. Maßstabsleiste, 1 cm. d, Ein repräsentatives Bild des Tabaks (Nicotiana benthamiana), der 5 Tage nach der Agrarinfiltration 35S::WRKY18 trägt, mit 35S::GFP als Kontrolle. Es wurden drei biologische Replikate mit ähnlichem Phänotyp beobachtet. Für die Agro-Infiltration wurden fünf Wochen alte Tabakblätter verwendet. Die rechten Felder sind Nahaufnahmen der Regionen mit roten Rahmen. Maßstabsleiste, 1 cm. e, Quantitative RT-PCR, die die Transkriptionsniveaus von WRKY18 in Blattgeweben zeigt, die ChiA1Ax oder ChiA1Ex überexprimieren, wie in Abb. 3d dargestellt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten (n = 3) dargestellt. ***P < 0,001; zweiseitiger Student-t-Test (P = 0,0000).

Quelldaten

ChiA1 befindet sich am Rand einer Region von Chromosom 2, wo die Rekombination bei Kreuzungen zwischen P. axillaris N und P. exserta stark reduziert ist19 (Abb. 6a). Tatsächlich ist ChiA1 eng (1,63 cM) mit MYB-FL verknüpft, einem gut charakterisierten Gen innerhalb des Supergens, das für die Zunahme und den Verlust der floralen UV-Absorption während evolutionärer Veränderungen der Bestäuberpräferenz verantwortlich ist21 (Abb. 6a und Ergänzungstabelle 7). .

a, Eine schematische Darstellung, die die Supergenregion (gelb gefärbt) in Chromosom 2 zwischen P. axillaris und P. exserta zeigt. Die Supergenregion ist von EOBII bis MYB3 definiert, wie zuvor von Hermann et al.19 berichtet. b, Karten von Regionen in Südamerika, die die Standorte (schwarze Punkte) zeigen, an denen wilde Akzessionen von P. axillaris (links) und P. exserta (rechts) gesammelt wurden. Akzessionen in einer nahe gelegenen Region wurden zur Berechnung der Allelhäufigkeit gruppiert (schwarze oder rote ausgefüllte Quadrate). Regionale Allelhäufigkeiten werden als Mini-Kreisdiagramme neben den Quadraten angezeigt. Die gesamten Allelfrequenzen für ChiA1Ax und ChiA1Ex in den beiden Sammlungen werden in den unteren linken Ecken angezeigt. Die gelbe Farbe zeigt das ChiA1Ax-Allel an. Die rote Farbe zeigt das ChiA1Ex-Allel an. Beitritte in der Nähe der Region Corrientes sind rot eingerahmt. Das rot gestrichelte Quadrat umfasst den Lebensraum von P. exserta, rechts vergrößert dargestellt. Detaillierte Genotypen und Standortinformationen finden Sie in den Ergänzungstabellen 9 und 10. c, Schematische Darstellung der vorhergesagten Interaktion von präzygotischen und postzygotischen Barrieren zwischen P. axillaris und P. exserta. ChiA1 ist eng mit mehreren Genen verknüpft, die Bestäubungssyndrome im Supergen steuern. Die verschiedenen Bestäubungssyndrome halfen den Arten, sich an ihre entsprechenden Bestäuber anzupassen. Der HN hilft dabei, die richtigen Kombinationen von Blütenmerkmalen für seinen Bestäuber festzulegen und verbessert so die Isolation. d, Modell des molekularen Mechanismus von HN. Links: Interaktion von P. axillaris ChiA1 in voller Länge und aktivem P. exserta HNe7 induziert Nekrose. Diese Interaktion erfolgt über eine positive Rückkopplungsschleife, die ER-Stress und WRKY-Transkriptionsfaktor(en) umfasst. Mitte: verkürztes P. exserta oder chia1-cas9-1 ChiA1 induziert kein aktives P. exserta HNe7, da sich ChiA1-mRNA aufgrund von NMD nicht ansammelt. Rechts: P. axillaris ChiA1 in voller Länge verursacht in Kombination mit inaktivem P. exserta HNe7 keine Symptome.

Die Analyse von ChiA1 und seinen benachbarten Genen zeigte eine klare Mikrosyntenie zwischen Petunia und den verwandten Solanaceae-Arten Solanum lycopersicum (Tomate) und S. tuberosum (Kartoffel). Bei diesen beiden Solanum-Arten ist MYB-FL jedoch nicht mit ChiA1 verknüpft, sondern befindet sich auf einem anderen Chromosom (Erweiterte Daten, Abb. 8 und Ergänzungstabelle 8). Die ausschließliche genetische Verbindung zwischen ChiA1 und MYB-FL in Petunien steht im Einklang mit der Annahme, dass der ChiA1-vermittelte HN eine postzygotische Barriere darstellt, die zusammen mit der präzygotischen Barriere den Genfluss begrenzt.

Um die Häufigkeiten der beiden Allele von ChiA1 zu analysieren, haben wir ChiA1 im gesamten Bereich der beiden Arten genotypisiert (Einzelheiten finden Sie in den Ergänzungstabellen 9 und 10). P. exserta wurde an 18 Standorten beprobt, was seine stark eingeschränkte Verbreitung in der Guaritas-Region in Brasilien darstellt. Von den 75 genotypisierten P. exserta-Akzessionen waren 58 homozygot für die Nonsense-Mutation (ChiA1Ex), 13 homozygot für den P. axillaris-Genotyp (ChiA1Ax) und 4 heterozygot (Abb. 6b, rechts, erweiterte Daten Abb. 9 und Ergänzung). Tabelle 9). Die Gesamthäufigkeit des ChiA1Ex-Allels unter diesen Akzessionen betrug 80 % (Abb. 6b, rechts).

P. axillaris-Akzessionen wurden an mehreren Standorten in Argentinien, Uruguay und Brasilien beprobt, einschließlich der Sympatry-Regionen mit P. exserta (Abb. 6b, links, rot gestricheltes Quadrat). Von den 238 P. axillaris-Akzessionen waren 173 homozygot für das P. axillaris-Allel (ChiA1Ax), 61 homozygot für das P. exserta-Allel (ChiA1Ex) und 4 heterozygot (Abb. 6b, links und Ergänzungstabelle 10). Die Gesamthäufigkeit des ChiA1Ax-Allels unter diesen Akzessionen betrug 74 % (Abb. 6b, links). Zweiundsechzig P. axillaris-Akzessionen mit dem ChiA1Ex-Allel befinden sich in den Regionen Corrientes und Entre Ríos in Argentinien (Abb. 6b, durchgezogenes Quadrat in Rot), etwa 500 km von der Guaritas-Region entfernt, in der ausschließlich P. exserta-Akzessionen vorkommen gefunden. Diese Akzessionen gehören zur P. axillaris-Unterart parodii48, die sich von P. axillaris ssp. unterscheidet. axillaris hauptsächlich durch seine längere Kronröhre49.

Diese Ergebnisse bestätigen das Vorhandensein beider ChiA1-Allele in den natürlichen Populationen von P. axillaris und P. exserta. ChiA1Ex kommt in P. exserta häufiger vor, wohingegen ChiA1Ax in P. axillaris häufiger vorkommt.

Wir entdeckten einen Fall von HN bei Kreuzungen zwischen P. axillaris und P. exserta, der auf einer schädlichen epistatischen Wechselwirkung zwischen den HNe2- und HNe7-Loci beruhte (Abb. 6c). Das HNe2 zugrunde liegende Gen ist ChiA1, das ein Protein mit sowohl Chitinase- als auch Lysozymaktivität kodiert. Das ChiA1Ax-Allel kodiert für ein funktionelles Enzym, wohingegen ChiA1Ex eine Nonsense-Mutation aufweist, die zu einem vorzeitigen Stoppcodon führt.

Fälle von HN, die bei mehreren Arten auftreten, weisen häufig Gemeinsamkeiten auf: Aktivierung von Immunantworten und die direkte Beteiligung von Komponenten des Immunsystems10. In einem gut untersuchten Fall bei Tomaten verursacht eine sezernierte Cysteinprotease eine Autoimmunität, wenn das Allel einer verwandten Wildart in Kombination mit einem Avirulenzrezeptor (Avr) der Kulturtomate vorhanden ist50,51. In diesem Beispiel wird jedoch angenommen, dass die Proteaseaktivität des Enzyms essentiell ist, wohingegen der Ersatz der kritischen Aminosäuren im aktiven Zentrum von ChiA1 seine Fähigkeit, Nekrose zu verursachen, nicht beeinträchtigt (Abb. 4e).

Wenn es nicht die Aktivität des Proteins ist, durch welchen Mechanismus verursacht ChiA1 Nekrose? Das Expressionsniveau ist für ChiA1Ax in IL5-Ax hoch, für die ChiA1Ex- und chia1-cas9-1-Allele jedoch niedrig. Die geringe Expression von ChiA1Ex und chia1-cas9-1 wird höchstwahrscheinlich durch den mRNA-Überwachungsweg durch die mRNA-NMD-Mechanismen verursacht38. Im Gegensatz dazu ist ChiA1Ax eines der am stärksten exprimierten Gene im nekrotischen IL5-Ax-Hintergrund. Die hohe Expression von ER-Stress-Markergenen im gleichen Hintergrund weist auf ER-Stress hin. Viele wichtige Proteine ​​im Zusammenhang mit der Pathogenese sind für eine ordnungsgemäße Faltung und Sekretion auf ER und ER-Qualitätskontrolle angewiesen52,53,54. Wir schlagen vor, dass der hohe und chronische Bedarf an der Verarbeitung von ChiA1 im ER die Arbeitskapazität der ER-Qualitätskontrolle übersteigt und zu anhaltendem ER-Stress und Zelltod führt55,56,57.

Angesichts der extrem hohen Expression von ChiA1Ax in der nekrotischen Linie erscheint eine positive Rückkopplungsschleife zwischen den beiden interagierenden Loci plausibel (Abb. 6d). Die basale Expression von ChiA1Ax in der nekrotischen Linie kann die Aktivierung von HNe7Ex auslösen (wahrscheinlich über WRKY18), und somit induziert HNe7Ex eine Autoimmunität, die die Expression von ChiA1 weiter verstärkt. In diesem Fall kodiert HNe7 möglicherweise eine autoaktive Komponente des Immunsystems (z. B. NLR10). Alternativ aktiviert HNe7Ex die Expression von ChiA1Ax und ChiA1Ax induziert die Autoimmunität. In diesem Fall könnte HNe7 ein Transkriptions- oder Posttranskriptionsregulator sein. HNe7 befindet sich in einer großen Region mit sehr geringer Rekombination, die fast 1.000 Gene enthält, und seine Identität ist noch nicht bekannt. Daher müssen die molekularen Details der Wechselwirkung von ChiA1 und HNe7 noch bestimmt werden.

Ein einzigartiger Aspekt der hier vorgestellten Arbeit besteht darin, dass ChiA1 eng mit einer Region mit geringer Rekombination verbunden ist, die wichtige Gene enthält, die an der Entwicklung von Bestäubungssyndromen beteiligt sind. Darunter ist MYB-FL, das für einen Transkriptionsfaktor kodiert, der die Synthese UV-absorbierender Pigmente im von Motten bestäubten P. axillaris induziert, im von Kolibris bestäubten P. exserta jedoch inaktiviert wurde19,21. Diese genetische Verknüpfung ist relativ neu, da sich ChiA1 und MYB-FL auf unterschiedlichen Chromosomen in Tomaten und Kartoffeln befinden (Extended Data Abb. 8). Diese Assoziation könnte dazu gedient haben, die reproduktive Isolation während des Artbildungsprozesses zu verstärken.

Sowohl die ChiA1Ax- als auch die ChiA1Ex-Allele wurden sowohl in P. axillaris- als auch in P. exserta-Wildakzessionen gefunden, die an mehreren Standorten in Südamerika gesammelt wurden (Abb. 6b). Das Vorhandensein von ChiA1Ax in wildem P. exserta könnte auf Introgression zurückzuführen sein58. P. axillaris ssp. parodii erreicht heute nicht die P. exserta-Region, und in der Vergangenheit gab es in der Serra do Sudeste keine geeigneten Bedingungen für P. parodii, selbst wenn man das letzte glaziale Maximum (~ 22 kya) oder das mittlere Holozän (6 kya) berücksichtigte59. Das Vorhandensein von ChiA1Ex in P. axillaris ssp. parodii deutet stark auf eine unvollständige Abstammungssortierung60 hin, was mit einer Funktion bei der reproduktiven Isolation während der Artbildung übereinstimmt. Da Chitinasen eine wichtige Rolle bei der mustergesteuerten Immunität gegen Krankheitserreger spielen, ist es wahrscheinlich, dass der Verlust der ChiA1-Funktion die Abwehr beeinträchtigt. Der potenzielle Nutzen des ChiA1Ex-Allels bei allopatrischem P. axillaris ssp. parodii-Populationen müssen weiter untersucht werden. Das Vorhandensein von ChiA1Ax in P. exserta deutet auf Zustände hin, bei denen die Vorteile der Pathogenresistenz ihre Auswirkungen auf die reproduktive Isolation überwiegen.

Zur Artbildung kommt es, wenn sich Fortpflanzungsbarrieren anhäufen und den Genfluss zwischen den Abstammungslinien erheblich reduzieren3. Die Bevorzugung von Bestäubern stellt ein starkes Hindernis für den Genfluss dar, ist jedoch selten absolut61. Dies gilt auch für Petunia62. Daher sind oft mehrere gemeinsam wirkende Fortpflanzungsbarrieren erforderlich, um die Fortpflanzungsisolation zu vervollständigen63,64. Die genetische Verknüpfung unterschiedlicher Isolationsmechanismen würde die reproduktive Isolation weiter verstärken und dadurch das Tempo der Diversifizierung und Artbildung erhöhen. Eine solche Verknüpfung könnte ein allgemeineres Phänomen sein, das zur Erklärung der schnellen und erfolgreichen Diversifizierung der Angiospermen beitragen kann.

P. axillaris N stammt aus dem Botanischen Garten Rostock (Deutschland), P. exserta stammt aus RJ Griesbach (Beltsville, USA). Die Akzessionen werden durch Selbstbefruchtung aufrechterhalten. Die Introgressionslinie IL5 wurde bereits beschrieben28. Wildakzessionen von P. axillaris und P. exserta wurden bereits beschrieben 21, 23, 25, 48 und werden in den Ergänzungstabellen 9 und 10 näher beschrieben.

Die Pflanzen wurden in einem Gewächshaus oder einer Wachstumskammer gezüchtet. Gewächshauspflanzen wurden mit zusätzlicher Beleuchtung 14 Stunden am Tag bei 18–25 °C in Töpfen gezüchtet. Pflanzen, die in einer Wachstumskammer gezüchtet werden, stehen unter einem Licht-Dunkel-Regime von 15 Stunden:9 Stunden, bei 22 °C:17 °C und 60–80 % relativer Luftfeuchtigkeit in handelsüblicher Erde (70 % Klasman-Substrat, 15 % Seramis-Ton). Granulat und 15 % Quarzsand) und einmal pro Woche gedüngt (Plantaktiv, 16+6+26 Dünger Typ K, 0,1 % Konzentration).

Die Diaminobenzidin (DAB)-Färbung wurde gemäß einem früheren Protokoll65 durchgeführt. Nach der Behandlung wurde das Blatt zur sofortigen Beobachtung verwendet oder bei 4 °C aufbewahrt.

Die Gesamt-RNA wurde mit einem innuPREP DNA/RNA Mini Kit (Analytik Jena; Code 845-KS-20800250) aus Blattgewebe extrahiert. Komplementäre DNA wurde mit dem qScriber cDNA Synthesis Kit (HighQu; Code RTK0104) synthetisiert. Quantitative PCR-Reaktionen wurden mit ORA SEE qPCR Green ROX L Mix (HighQu; Code QPD0505) durchgeführt. Die Amplifikation wurde mit einem QuantStudio 5 Real-Time PCR Instrument (Applied Biosystems) durchgeführt. Für jeden Genotyp wurden Blätter von drei einzelnen Pflanzen entnommen. Wir haben die siebtältesten Blätter (von unten nach oben gezählt; ungefähr das sechstneueste von oben nach unten gezählt) von den 10 Wochen alten Pflanzen genommen, da dieses Blatt in IL5-Ax-Pflanzen in diesem Stadium beginnt, nekrotische Symptome zu zeigen. Die Daten wurden mit der ∆∆Ct-Methode66 analysiert und mit dem Housekeeping-RAN1-Gen21 normalisiert. Primerpaare für die quantitative PCR sind in der Ergänzungstabelle 11 aufgeführt.

Das Verhältnis der Blattgelbfläche wurde auf der Grundlage einer früheren Methode mit Modifikationen berechnet67. Kurz gesagt, von jeder Pflanze wurden Blätter entfernt und auf einem schwarzen Hintergrund unter gleichmäßigen künstlichen Lichtbedingungen fotografiert, wobei jedem Foto eine Farbreferenzkarte beigefügt war. Zur Verarbeitung der Bilder wurde die Software Fiji (ImageJ) verwendet68. Die Gesamtblattfläche sowie die gelbe und grüne Blattfläche wurden anhand von Farbschwellenwerten für Farbton-, Sättigungs- und Helligkeitswerte gemessen. Es wurden nur Bilder verglichen, die in derselben Sitzung aufgenommen wurden, um eine gleichmäßige Beleuchtung zu gewährleisten. Um die Farbtonparameter zu definieren, die einen Bereich als gelb kennzeichnen, haben wir die Parameter zunächst auf die Farbreferenzkarte in jedem Foto angewendet und überprüft, ob die identifizierten gelben Bereiche konsistent sind. Der auf den Farbkarten gemessene gelbe Bereich ist in Abb. 10 der erweiterten Daten dargestellt. Anschließend haben wir die Farbtonschwellen zur Analyse der Blattfotos verwendet. Das Fidschi-Makro gibt eine gemalte Version der Fotos aus, in der der gemessene gelbe Bereich angezeigt wird. Wir haben manuell überprüft, ob dieser Bereich die gelben Teile der Blätter korrekt überlappt. Detaillierte Skripte und Anleitungen finden Sie hier: https://github.com/Kuhlemeier-lab/fiji_macros.

Wir haben die von Soyk et al.69 veröffentlichte Methode für BSR-seq (eine Bulk-Segregant-Analyse basierend auf RNA-seq-Daten) verwendet, um die für HN verantwortlichen Loci zu kartieren. Zur Erzeugung einer F2-Population wurden P. axillaris N (Mutterpflanze) und P. exserta (Pollenspender) verwendet. Zur Probenahme wurden insgesamt 384 F2-Pflanzen ausgesät. Auf der Grundlage der in Abb. 2a dargestellten phänotypischen Skala wählten wir 13 Wochen nach der Aussaat Pflanzen aus, die einen starken nekrotischen Blattphänotyp (19 Individuen, Punktzahl 4) oder einen gesunden Blattphänotyp (89 Individuen, Punktzahl 0) zeigten. Von einem reifen und gesunden Blatt jeder Pflanze wurde eine Blattscheibe (Ø = 9 mm) entnommen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C gelagert. Die Gesamt-RNA wurde aus Pools von Blattscheiben entweder der nekrotischen Pflanzen oder der gesunden Pflanzen extrahiert. Die RNA-Seq wurde von NovoGene mit einer PolyA-angereicherten Bibliotheksvorbereitung durchgeführt, um Paired-End-Reads von 150 bp zu erhalten. Die Ausrichtung qualitätskontrollierter Lesevorgänge wurde mit STAR70 (2.6.0c) am Referenzgenom von P. axillaris N Version 4.03 durchgeführt. Varianten wurden mit GATK71 (4.0.4.0) aufgerufen. Die Varianten wurden gefiltert, um nur hochwertige biallelische Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) mit einer Mindestlesetiefe von 100 in jeder Probe (unter Verwendung des minDP-Arguments in vcftools) und mit mindestens 100 bp zwischen jeder Variantenposition beizubehalten. Wir haben den Unterschied in der alternativen Allelfrequenz zwischen den beiden Pools (nekrotisch – gesund) berechnet und diese ∆SNP-Frequenz verwendet, um genomweite Schwellenwerte bei den Quantilen 0,01 und 0,05 (untere Schwellenwerte) und 0,95 und 0,99 (höhere Schwellenwerte) zu definieren. Die SNPs wurden dann in Schrittfenstern von 100 SNPs entlang des Genoms gruppiert und der Anteil der SNPs mit Werten außerhalb der genomweiten Schwellenwerte in jedem Fenster wurde zur Erstellung der Hauptzahl verwendet. Berechnungen und Darstellungen der Allelfrequenz wurden in R72 durchgeführt. Detaillierte Parameter, Softwareversionen und Skripte sind auf Github hinterlegt: https://github.com/Kuhlemeier-lab/Petunia_hybrid_necrosis#bsr-seq.

Da es sich bei IL5-Het um eine nahezu isogene Linie handelt, die sich für eine Chromosom-2-Region mit HNe2 trennt, während der Rest des Genoms homozygot ist, verwenden wir sie als Ausgangsmaterial für die Suche nach rekombinanten Linien unter ihren Nachkommen und reduzieren die Größe des Intervalls von Interesse. Wir haben 3.800 Nachkommen von IL5-Het mit den Markern mHIND-cn9140 und mHIND-MYB58 gescreent, die die heterozygote Region flankieren, was die Identifizierung von 37 rekombinanten Linien ermöglichte (Ergänzungstabelle 1). Diese Linien enthalten eine kleinere heterozygote Region im Vergleich zu IL5-Het, die unter Hinzufügung weiterer genetischer Marker genotypisch charakterisiert wurden (Ergänzungstabellen 1 und 11). Anschließend ermöglichte die phänotypische Charakterisierung homozygoter Nachkommen dieser rekombinanten Linien die Feinkartierung von HNe2 bis hin zu einer 8,7-MB-Region (Ergänzungstabelle 1).

Um eine bessere Auflösung der Rekombinationsbruchpunkte zu erreichen und den HNe2-Locus zu reduzieren, wurden zehn informative rekombinante Linien und vier für die HNe2-Region homozygote Kontrollen (zwei P. axillaris und zwei P. exserta) für die Sequenzierung des gesamten Genoms ausgewählt (Ergänzungstabelle 1). Die Extraktion genomischer DNA aus Blattgewebe der ausgewählten Linien wurde mit einer modifizierten CTAB-Methode durchgeführt, wie bereits berichtet73. Die DNA wurde von der Next-Generation-Sequencing-Plattform der Universität Bern unter Verwendung der Illumina-Bibliotheksvorbereitung für die Gesamtgenomsequenzierung sequenziert, um Paired-End-150-bp-Reads zu erhalten. Qualitätskontrollierte Lesevorgänge wurden mit BWA-MEM-Standardparametern74 an das Genom von P. axillaris N v. 4.03 angepasst, was eine durchschnittliche Abdeckung von 3,3 × entlang des Genoms ergab. Mit GATK71 wurden Varianten aufgerufen und qualitätsgefiltert. Die Beobachtung der Genotypen der Varianten, die mit dem HN-Phänotyp in den rekombinanten Linien assoziiert sind, ermöglichte eine Verringerung der Größe der Region, die HNe2 enthält. Die detaillierten Softwareversionen, Parameter und Skripte sind auf Github hinterlegt: https://github.com/Kuhlemeier-lab/Petunia_hybrid_necrosis#il-shallow-sequencing.

Für die Blattprobenahme wurden IL5-Ax- und IL5-Ex-Pflanzen gezüchtet, die von demselben IL5-Het-Elternteil stammten. Das Blatt, das den Beginn einer Nekrose in IL5-Ax zeigte, wurde geerntet und gleichwertige Blätter wurden für die anderen Genotypen beprobt. Für jeden Genotyp wurden drei biologische Replikate von drei verschiedenen Pflanzen festgelegt. Die Gesamt-RNA wurde mit einem innuPREP DNA/RNA Mini Kit (Analytik Jena; Code: 845-KS-20800250) aus Blattgewebe extrahiert. Qualitätskontrollen wurden mit einem Nanodrop (NanoDrop 1000, Thermo Fisher) und einem Fragmentanalysator (2100 Bioanalyzer Instrument, Agilent) durchgeführt. Die RNA-Sequenzierung wurde von der Lausanne Genomic Technologies Facility (Universität Lausanne) mit der Vorbereitung der TruSeq-Strang-RNA-Bibliothek durchgeführt, um Single-End-Reads von 125 bp zu erhalten. Qualitätskontrollierte Lesevorgänge wurden mithilfe von STAR70 mit dem Referenzgenom von P. axillaris Version 4.03 abgeglichen. Lesezahlen wurden mit Subread75 generiert. Die Analyse der differentiellen Expression wurde mit DESeq2 in R76 zwischen IL5-Ax und IL5-Ex (q <0,001) durchgeführt. Die detaillierten Softwareversionen, Parameter und Skripte sind auf Github hinterlegt: https://github.com/Kuhlemeier-lab/Petunia_hybrid_necrosis#rnaseq.

ChiA1 und seine homologen Sequenzen von Arten, die in Abb. 4c der erweiterten Daten aufgeführt sind, wurden in der NCBI-Datenbank Nr. (nicht redundante Proteinsequenzen) identifiziert, indem eine BLASTp-Suche mit ChiA1-Proteinsequenzen durchgeführt wurde (Ergänzungstabelle 12). Aminosäuresequenzen wurden mit MUSCLE im MEGA-X-Softwarepaket unter Verwendung der Standardeinstellungen für Protein-Mehrfach-Alignments ausgerichtet. Evolutionsabstände wurden mithilfe der Poisson-Korrekturanalyse berechnet. Für Phylogenietests wurde die Bootstrap-Methode mit 1.000 Replikaten verwendet.

Die Strukturen von ChiA1-Varianten wurden von AlphaFold77 vorhergesagt. Die Strukturen wurden mit PyMOL (Version 2.5.3, Schrödinger LLC) visualisiert und ausgerichtet.

VIGS wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt23. Für jedes Kandidatengen haben wir einen bestimmten Teil der kodierenden Region gezielt ausgewählt, um Off-Targeting zu vermeiden (Ergänzungstabelle 11). Nach der Amplifikation mit Primern, die BamHI- und EcoRI-Restriktionsstellen enthielten, wurden diese Fragmente in das pTRV2-MCS-Plasmid (ABRC-Zugang CD3-1040) kloniert und in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101 transformiert. Sieben Wochen nach der Infektion wurden nur Blätter der Zweige infizierter Meristeme phänotypisiert.

Die ChiA1D148A- und E150A-Kodierungssequenz wurde durch die PCR-Mutagenesemethode mit ChiA1Ax als Matrize erzeugt. Die kodierenden Sequenzen von ChiA1Ax, ChiA1D148A, E150A und ChiA1Ex wurden mit Primern amplifiziert, die AttB-Stellen enthielten (Ergänzungstabelle 11) und in den Gateway-kompatiblen binären Vektor pGWB402 (Addgene-Plasmid Nr. 74796) kloniert, der einen CaMV35S-Promotor enthielt. Zur vorübergehenden Überexpression wurden die Konstrukte in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101 transformiert. Die Agrobacterium-Zellen wurden bis zu einer OD600 von 0,8 gezüchtet, pelletiert und in Infiltrationspuffer (10 mM Methylestersulfonat, 10 mM MgCl2 und 150 µM Acetosyringon, pH 5,7) resuspendiert und in 7 oder 8 Wochen alte P. exserta oder 5 infiltriert Eine Woche alte Nicotiana-Benthamiana-Pflanze verlässt man mit einer nadellosen Spritze. Der Phänotyp wurde 2 Wochen (Petunia) bzw. 5 Tage (Nicotiana) nach der Infiltration beobachtet. Stabile transgene P. axillaris N-Linien wurden durch Blattscheibentransformation mit dem Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101 nach einem angepassten Protokoll23 basierend auf Conner et al.78 erzeugt.

Das CRISPR-Cas9-Konstrukt für ChiA1 pHSE401(Neo/Kana)-U6-26p > CHIAb[gRNA#1]-U6-26p>CHIAb[gRNA#2] wurde bei VectorBuilder (https://en.vectorbuilder.com/) bestellt. . gRNA 1: CTCACGTCCACTAGGAGATG, gRNA 2: AGGGAGGGACAGCAGAACAT. Das Konstrukt wurde in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 transformiert. Die IL5-Ax-CRISPR-Cas9-Linie wurde mit dem Agrobacterium durch Blattscheibentransformation nach dem gleichen Protokoll für stabile transgene P. axillaris N-Linien erzeugt. Die Bearbeitung in der T0-Generation wurde durch PCR nachgewiesen, die an genomischer DNA mit Primern durchgeführt wurde, die auf die gRNA-Stellen abzielten (Ergänzungstabelle 11), gefolgt von einer Sanger-Sequenzierung.

Blattapoplastische Proteine ​​wurden durch Vakuuminfiltration von 7 Wochen alten Petunien-Pflanzenblättern (dem Stadium, in dem IL5-Ax-Pflanzen beginnen, nekrotische Symptome zu zeigen) mit Aktivitätspuffer aus dem Chitinase Assay Kit (abbexa, Katalog: abx298854) oder dem Lysozym Activity Assay Kit erhalten (Fluorometrisch) (Abcam, Katalog: ab211113). Die Blätter wurden auf einem Papiertuch getrocknet. Anschließend wurden mit einem Locher Blattscheiben (Ø = 9 mm) entnommen, sodass die Gesamtfläche der für die Proteinextraktion verwendeten Blätter bestimmt werden konnte. Zweiundzwanzig Blattscheiben von drei Pflanzen wurden als ein biologisches Replikat zusammengefasst. Anschließend wurden die gepoolten Blattscheiben in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen gegeben und 5 Minuten lang bei 4 °C und 1.000 g geschleudert. Für jeden getesteten Genotyp wurden drei biologische Replikate (3 × 22 Blattscheiben von neun Pflanzen) erstellt.

Die Chitinase-Aktivität wurde mit einem Chitinase-Assay-Kit (abbexa, Code: abx298854) gemäß dem Standardprotokoll nachgewiesen. Eine Einheit Chitinaseaktivität wurde als die Enzymmenge definiert, die erforderlich ist, um 1 µg N-Acetylglucosamin pro Stunde bei 37 °C zu produzieren. Die Lysozym-Aktivität wurde mit dem Lysozym-Aktivitäts-Assay-Kit (Fluorometrische) (Abcam, Code: ab211113) gemäß dem Standardprotokoll nachgewiesen. Eine Einheit Lysozymaktivität wurde als die Enzymmenge definiert, die 1,0 μmol 4-MU pro Minute bei pH 5,0 und 37 °C erzeugt.

Als Behälter für die sterile Kultur wurden transparente 5-Liter-Becher verwendet. Die Becher mit 1,5 Liter handelsüblicher Erde (70 % Klasman-Substrat, 15 % Seramis-Tongranulat und 15 % Quarzsand) wurden mit Aluminiumfolie verschlossen und 20 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert. Dann wurden 500 ml autoklaviertes Wasser in einer sterilen Umgebung unter laminarer Strömung in das Becherglas gegeben. Samen mit dem Genotyp IL5-Ax und IL5-Ex wurden mit 1 % Bleichmittel 10 Minuten lang sterilisiert und fünfmal in sterilem Wasser gespült. Anschließend wurden die Samen in einer sterilen Umgebung in die Becher gesät. Die Becher wurden mit mehreren Lagen transparenter Kunststofffolie verschlossen und in die Wachstumskammer gestellt. Die Phänotypen der Blätter wurden 12 Wochen nach der Aussaat analysiert. Für jeden Genotyp wurden vier biologische Replikate mit ähnlichen Ergebnissen beobachtet.

Ein-Kilobasen-Promotorsequenzen (1 kb stromaufwärts der Translationsstartcodons) der DEGs wurden extrahiert und der Motiverkennung durch MEME-ChIP79 (http://meme-suite.org/tools/meme-chip) mit Standardparametern unterzogen.

Die Genotypen von ChiA1 in den Wildakzessionen von P. axillaris und P. exserta wurden durch den CAPS-Marker bestimmt, der an der Nonsense-Mutationsstelle entworfen wurde. Die G-zu-T-Mutation im P. exserta-Allel von ChiA1 beeinträchtigt die Verdauungsstelle des Restriktionsenzyms FokI (GGATGN7). CAPS-Marker-Primersequenzen finden Sie in der Ergänzungstabelle 11. Die Genotypen von MYB-FL wurden wie zuvor beschrieben bestimmt21.

Sequenzen von MYB-FL, ChiA1 und seinen vier benachbarten Genen im Genom wurden gegen die cDNA-Bibliothek ITAG Release 4.0 für S. lycopersicum und die cDNA-Bibliothek PGSC DM4.03 für S. tuberosum BLASTed. Detaillierte Gen-IDs und Koordinaten der in der Mikrosyntenie-Analyse gezeigten Gene finden Sie in der Ergänzungstabelle 8.

Für die statistischen Analysen (einseitige Varianzanalyse (ANOVA) und zweiseitiger Student-t-Test) wurden GraphPad Prism v.6.0.7 und Microsoft Excel 2016 verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

BSR-seq-Lesevorgänge wurden im NCBI Sequence Read Archive (SRA) unter BioProject PRJNA708139 hinterlegt. Flache Lesedaten zur Gesamtgenomsequenzierung wurden unter BioProject PRJNA705072 hinterlegt. RNA-seq-Reads wurden unter BioProject PRJNA705649 hinterlegt. Die Genomassemblierung von P. axillaris N 4.03 wurde bei der NCBI GenBank unter der Zugangsnummer JANRMM000000000 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=JANRMM000000000) hinterlegt.

Alle in diesem Artikel verwendeten Skripte wurden auf Github hinterlegt: https://github.com/Kuhlemeier-lab/Petunia_hybrid_necrosis. Die wichtigsten Berechnungen wurden auf einem SLURM-Rechnercluster (UBELIX http://www.id.unibe.ch/hpc, dem HPC-Cluster der Universität Bern) durchgeführt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken T. Nuernberger für die kritische Lektüre des Manuskripts, M. Chopy und D. Bonnet für hilfreiche Diskussion und Korrekturlesen, T. Mandel und L. Lebeigle für technische Unterstützung und C. Ball, J. Sekulovski und S. Dolder für die fachkundige Betreuung der Pflanzen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Schweizerischen Nationalfonds (31003A_182340 an CK) und der Europäischen Union (ERC AdG 741354-RESPEC an CK) unterstützt.

Open-Access-Förderung der Universität Bern.

Vivien Pichon

Derzeitige Adresse: Institut für Biologie, Universität Freiburg, Freiburg, Schweiz

Gina Cannarozzi

Derzeitige Adresse: Informationszentrum Chemie/Biologie/Pharmazie, ETH Zürich, Zürich, Schweiz

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Mathieu Hanemian, Cris Kuhlemeier.

Institut für Pflanzenwissenschaften, Universität Bern, Bern, Schweiz

Chaobin Li, Marta Binaghi, Vivien Pichon, Gina Cannarozzi, Mathieu Hanemian und Cris Kuhlemeier

Abteilung für Genetik, Labor für molekulare Evolution, Bundesuniversität Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brasilien

Loreta Brandão de Freitas

Labor für Pflanzen-Mikroben-Umwelt-Interaktionen (LIPME), INRAE, CNRS, Universität Toulouse, Castanet-Tolosan, Frankreich

Mathieu Hanemian

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CK, MH und CL konzipierten die Studie, gestalteten die Experimente und analysierten die Daten. CL und MH führten pflanzenbezogene Experimente durch. MB entwickelte die Skripte und verarbeitete die Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten. VP führte eine ROS-Analyse durch und leistete technischen Support. GC führte Proteinstrukturmodellierung und Genomassemblierung durch. LBdF führte Feldarbeiten durch und steuerte die Materialien bei. CL und CK haben den Artikel mit Beiträgen aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Mathieu Hanemian oder Cris Kuhlemeier.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Plants dankt Elena Kramer und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Pflanzenphänotyp von IL5-Ax und IL5-Ex an verschiedenen Tagen nach der Aussaat (DAS). b, Bewertung der ROS-Produktion mittels DAB-Färbung einer repräsentativen 5 Wochen alten IL5-Ex-Pflanze. DAB wurde durch Wasserstoffperoxid (ROS) oxidiert und braun gefärbt. Das Experiment wurde einmal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt (n = 2). c: Quantitative RT-PCR, die die Expressionsniveaus der Pathogenese-bezogenen Gene PR1, PR1B1 und PTI5 in Blättern von 10 Wochen alten P. axillaris N-, IL5-Ax-, IL5-Ex- und IL5-Het-Pflanzen zeigt. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten (n = 3) dargestellt. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin (P < 0,05, einfaktorielle ANOVA, Tukey-HSD-Test); Informationen zu P-Werten finden Sie unter Quelldaten. d, Quantitative RT-PCR, die die Expressionsniveaus der ER-Stressmarkergene BiP4, BiP5 und bZIP60 in Blättern von 10 Wochen alten P. axillaris N-, IL5-Ax-, IL5-Ex- und IL5-Het-Pflanzen zeigt. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten (n = 3) dargestellt. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin (P < 0,05, einfaktorielle ANOVA, Tukey-HSD-Test); Für P-Werte siehe Quelldaten.

Quelldaten

Punkte stellen den Häufigkeitsunterschied zwischen den Gruppen für jeden SNP dar. Ein y-Wert über 0 weist auf eine höhere Häufigkeit des P. exserta-Allels in der nekrotischen Gruppe hin. Dieser Trend ist in großen Teilen von Chr 7 zu beobachten. Ein y-Wert unter 0 weist auf eine höhere Häufigkeit des P. axillaris N-Allels in der nekrotischen Gruppe hin. Dieser Trend ist in großen Teilen von Chr 2 zu beobachten. Blaue Linien stellen die Löss-Glättung dar, wobei 0,95-Konfidenzintervalle hellgrau dargestellt sind. Gestrichelte Linien geben den genomweiten Quantilwert von 0,01 und 0,99 an, während strichpunktierte Linien den Quantilwert von 0,05 und 0,95 anzeigen.

Schematische Darstellung der Genotypen der informativsten SNP-Marker, die durch flache Sequenzierung von zehn informativen rekombinanten Linien erhalten wurden (Abb. 3a und Ergänzungstabelle 1). Die rote Farbe zeigt an, dass der Genotyp der Probe beim angegebenen SNP homozygot für P. exserta ist; Die gelbe Farbe zeigt an, dass der Genotyp einer Probe beim angegebenen SNP homozygot für P. axillaris N ist. Der schwarze Rahmen zeigt die Region an, die mit dem HN-Phänotyp in der Feinkartierung assoziiert ist.

a, Quantitative RT-PCR, die die Transkription von ChiA1 in P. axillaris N, IL5-Ax zeigt. IL5-Ex und IL5-Het verlässt. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten (n = 3) dargestellt. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin (P < 0,05, einfaktorielle ANOVA, Tukey-HSD-Test); Für P-Werte siehe Quelldaten. b, Domänenanmerkung von ChiA1, die darauf hindeutet, dass es sich um eine bifunktionelle Chitinase aus Glykosidhydrolase (GH18) mit einem Sekretionssignalpeptid (SP) handelt. c, Phylogenetische Beziehungen von ChiA1 und seinen Homologen in einigen anderen Arten. Die Entfernungen wurden mithilfe des Neighbor-Joining-Algorithmus geschätzt. Die Zahlen an den Knoten stellen ihr Konfidenzniveau dar, angezeigt als Prozentsatz von 1.000 Bootstraps. Der Maßstabsbalken gibt die durchschnittliche Anzahl der Aminosäuresubstitutionen pro Stelle an. Als Fremdgruppe wurde das Homolog von Arabidopsis thaliana verwendet. d, Nonsense-Mutation im ChiA1 P. exserta-Allel. Das obere Feld zeigt die schematische Darstellung von ChiA1 mit der G-zu-T-Nonsense-Mutation. Die mutierte Stelle ist durch ein Dreieck gekennzeichnet. Die dünne Linie zeigt das Intron an. Schwarze Kästchen zeigen die Exons an. Weiße Kästchen kennzeichnen die nicht übersetzten Regionen. Das untere Feld zeigt die Sanger-Sequenzierung, die die G-zu-T-Mutation von ChiA1 in P. exserta bestätigt. Das Sternchen gibt das Translationsstoppcodon an. e, Strukturmodelle von ChiA1Ax und ChiA1Ex, vorhergesagt von AlphaFold. Für die Strukturvorhersage werden Proteinsequenzen von ChiA1Ax und ChiA1Ex verwendet. f, Quantifizierung der ChiA1-Expressionsniveaus in IL5-Ex-Pflanzenblättern, die vorübergehend ChiA1Ax, ChiA1Ex, GFP oder Negativkontrollen überexprimieren. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt (n = 9 Blätter für jede Behandlung). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin (P < 0,05, einfaktorielle ANOVA, Tukey-HSD-Test); Für P-Werte siehe Quelldaten.

Quelldaten

a, Pflanzenphänotyp von Chia1-cas9-1 in IL5-Ax im Vergleich zu IL5-Ax und IL5-Ex in verschiedenen Wochen nach der Aussaat. b, Blattphänotyp von Chia1-cas9-1 in IL5-Ax im Vergleich zu IL5-Ax und IL5-Ex. Der Blattphänotyp wurde 13 Wochen nach der Aussaat fotografiert. Balken, 1 cm.

Sterile Kultur von IL5-Ax und IL5-Ex in einem versiegelten transparenten Becherglas (links) und jeweils ein repräsentatives Blatt von IL5-Ex- und IL5-Ax-Pflanzen in steriler Kultur (rechts). Balken, 1 cm.

A. Chitinase- und Lysozymaktivität in Blattgeweben, die vorübergehend ChiA1Ax, ChiA1Ex oder ChiA1D148A, E150A im 7 Wochen alten IL5-Ex-Hintergrund überexprimieren, mit der Überexpression von GFP, Infiltrationspuffer oder unbehandelten Pflanzenblättern als Kontrollen. Für jeden Genotyp wurden 9 Pflanzen verwendet und für Replikate in 3 gruppiert. Von jeder Gruppe wurden 66 Blattscheiben beprobt, um die insgesamt genutzte Blattfläche zu vereinheitlichen. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt. Verschiedene Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin (P < 0,05, einfaktorielle ANOVA, Tukey-HSD-Test); Für P-Werte siehe Quelldaten. b, Phänotyp von IL5-Ex-Blättern mit vorübergehender Überexpression von ChiA1D148A, E150A, ChiA1Ax, ChiA1Ex und GFP mit drei biologischen Replikaten. Für die Überexpression wurde der 35S-Promotor verwendet. Als Kontrollen wurden ChiA1Ex und GFP verwendet. Für die Agrarinfiltration wurden 7 oder 8 Wochen alte IL5-Ex-Pflanzenblätter verwendet. Die Fotos wurden 2 Wochen nach der Infiltration aufgenommen. Balken, 1 cm. C. Quantifizierung der ChiA1-Expressionsniveaus in IL5-Ex-Pflanzenblättern, die ChiA1Ax, ChiA1Ex, ChiA1D148A, E150A, GFP oder Negativkontrollen vorübergehend überexprimieren. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt (n = 4 Blätter für jede Behandlung). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin (P < 0,05, einfaktorielle ANOVA, Tukey-HSD-Test); Für P-Werte siehe Quelldaten.

Quelldaten

Die genomischen Sequenzen von ChiA1 und seinen vier benachbarten Genen sowie das MYB-FL-Gen wurden für eine BLAST-Suche gegen die Genomen von P. axillaris N, S. lycopersicum und S. tuberosum verwendet. Detaillierte Genzugangsnummern, Koordinaten und Genomversionen finden Sie in der Ergänzungstabelle 8 und im Abschnitt „Methoden“.

Der rote quadratische Bereich wurde im rechten Bereich vergrößert. Die regionale Allelhäufigkeit wird als Kreisdiagramm in der oberen linken Ecke angezeigt. Die gelbe Farbe zeigt das ChiA1Ax-Allel an. Die rote Farbe zeigt das ChiA1Ex-Allel an. Detaillierte Genotypen und Standortinformationen finden Sie in der Ergänzungstabelle 9.

Die Konsistenz der gelben Bereiche, die in jedem Bildsatz aus Abb. 3c (a), 3e (b), 3h (c) und 4d (d) identifiziert wurden, wurde mithilfe der in jedem Bild enthaltenen Farbkarte validiert.

Ergänzende Tabelle 1. Feinkartierung von HNe2 unter Verwendung rekombinanter Linien, die von IL5-Het abgeleitet sind. Ergänzende Tabelle 2. Liste der Gene innerhalb der endgültigen HNe2-Region. Ergänzende Tabelle 3. Expressionsniveau (normalisierte Lesezahlen) der in der HNe2-Region vorhandenen Gene. Ergänzende Tabelle 4. Merkmale der 34 exprimierten Gene in der HNe2-Region. Ergänzende Tabelle 5. Liste aller Gene, die zwischen IL5-Ax- und IL5-Ex-Pflanzenblättern unterschiedlich exprimiert werden. Ergänzende Tabelle 6. Liste der DEGs zwischen IL5-Ax- und IL5-Ex-Blättern, die in den Promotorregionen eine oder mehrere in Abb. 5a gezeigte WRKY-Bindungsstelle(n) tragen. Ergänzende Tabelle 7. Genetischer Abstand zwischen ChiA1 und MYB-FL, analysiert anhand einer F2-Population von 369 Personen. Ergänzende Tabelle 8. Gen-ID und Koordinaten der in der Mikrosyntenie-Analyse verwendeten Gene. Ergänzende Tabelle 9. Detaillierte Informationen zu Individuen in den Wildakzessionen von P. exserta. Ergänzende Tabelle 10. Detaillierte Informationen zu Individuen in den Wildakzessionen von P. axillaris. Ergänzende Tabelle 11. Grundierungsliste. Ergänzende Tabelle 12. Protein-IDs und Sequenzen, die in der phylogenetischen Analyse von ChiA1 verwendet werden.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Li, C., Binaghi, M., Pichon, V. et al. Enge genetische Verknüpfung von Genen, die Hybridnekrose und Bestäuberisolation zwischen jungen Arten verursacht. Nat. Pflanzen 9, 420–432 (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-023-01354-8

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Eingegangen: 01. September 2022

Angenommen: 19. Januar 2023

Veröffentlicht: 20. Februar 2023

Ausgabedatum: März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01354-8

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Theoretische und Angewandte Genetik (2023)