Titan

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 470 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Entwicklung neuer Biomaterialien mit hervorragenden mechanischen Eigenschaften und hoher Biokompatibilität war in den letzten Jahrzehnten eine große Herausforderung. Nanokristalline Metalle haben neue Möglichkeiten für die Herstellung hochfester Biomaterialien eröffnet, die Biokompatibilität dieser Nanometalle muss jedoch verbessert werden. In dieser Studie stellen wir Metall-Protein-Nanokomposite als hochfeste Biomaterialien mit überlegener Biokompatibilität vor. Kleine Anteile von Rinderserumalbumin (2 und 5 Vol.-%), einem im Säugetierkörper reichlich vorkommenden Protein, werden Titan zugesetzt, und zwei Nanokomposite werden mithilfe eines starken plastischen Verformungsprozesses der Hochdrucktorsion synthetisiert. Diese neuen Biomaterialien weisen nicht nur eine hohe Härte ähnlich nanokristallinem Reintitan auf, sondern weisen im Vergleich zu Nanotitan auch eine bessere Biokompatibilität (einschließlich zellulärer Stoffwechselaktivität, Zellzyklusparameter und DNA-Fragmentierungsprofil) auf. Diese Ergebnisse eröffnen einen Weg zur Entwicklung neuer biokompatibler Verbundwerkstoffe durch den Einsatz von Verbindungen aus dem menschlichen Körper.

Biomaterialien haben in den letzten Jahren für verschiedene Anwendungen große Aufmerksamkeit erhalten. Die Entwicklung metallischer Biomaterialien für Implantate ist aus wissenschaftlicher und technischer Sicht besonders kritisch, da die Implantate unter Belastung in direktem Kontakt mit menschlichen Körpergeweben, Knochen und Flüssigkeiten stehen. Der menschliche Körper ist eine sehr korrosive und komplexe Umgebung, die zum Auftreten verschiedener Korrosionstypen führt, wenn ein tragendes künstliches Material in den menschlichen Körper implantiert wird1,2,3. Die Körperflüssigkeit enthält verschiedene organische Verbindungen und eine bemerkenswerte Vielfalt an Proteinen. Im menschlichen Körper gibt es fast 105 verschiedene Proteine, von denen jedes eine spezifische Rolle hat. Von diesen Proteinen wurde berichtet, dass Albumin das am häufigsten vorkommende Protein im Plasma und in der Synovialflüssigkeit ist4 und daher in jedem menschlichen Gewebe vorhanden ist, in das ein künstliches Material implantiert werden könnte.

Eine der ersten Phasen, die die Biokompatibilität erheblich beeinflusst, ist die sofortige Adsorption von Proteinen aus biologischen Flüssigkeiten auf Biomaterialoberflächen1,2. Darüber hinaus gilt die Proteinadsorption als die erste und wichtigste Phase, die die Adhäsion von Zellen an der Biomaterialoberfläche ermöglicht, und daher finden in dieser Phase relevante klinische Phänomene wie die Osseointegration orthopädischer Implantate statt1,2,3,4. Albumin wurde als der stärkste Metallbinder unter den menschlichen Blutproteinen identifiziert, daher spielt die Adsorption von Albumin an Implantatoberflächen eine Schlüsselrolle bei der Bestimmung von Oberflächenfunktionen wie Biokompatibilität, Korrosion und Tribologie5. Proteine ​​bilden eine dicke Schicht auf der Oberfläche des Materials und Zellen nehmen durch diese Schicht hindurch fremde Oberflächen wahr und beginnen zu reagieren. Einige Berichte über Implantate zeigten deutlich das Vorhandensein proteinhaltiger Schichten auf der Oberfläche1,6, was auf die Bedeutung der Wechselwirkung von Proteinen mit biomedizinischen Legierungen auf zellulärer Ebene hinweist.

Titan und seine Legierungen werden aufgrund ihres niedrigen Elastizitätsmoduls, ihrer hohen Ermüdungsfestigkeit, ihrer hervorragenden Korrosionsbeständigkeit und ihrer besseren Biokompatibilität im Vergleich zu anderen Biomaterialien wie rostfreien Stählen und Co-Cr-Legierungen7,8 häufig als potenzielle Biomaterialien in vielen verschiedenen Implantaten verwendet Dichte von 4,5 g/cm3, was etwa der Hälfte der Dichte von Edelstählen und Co-Cr-Legierungen entspricht9. Der Hauptnachteil von Titan und seinen Legierungen ist jedoch ihre geringere Festigkeit und Härte im Vergleich zu rostfreien Stählen und Co-Cr-Legierungen7,8,9. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass die Nanostrukturierung von Titan eine wirksame Lösung zur Verbesserung seiner Festigkeit und Härte ist, ohne seine Biokompatibilität zu beeinträchtigen10,11.

Der erfolgreiche Einsatz von Titanimplantaten hängt nicht nur von mechanischen Eigenschaften wie Elastizitätsmodul und Härte ab, sondern auch von der Osseointegration an der Knochen-Implantat-Grenzfläche12. Aufgrund der fehlenden Bioaktivität von Materialien auf Ti-Basis können sie sich jedoch nicht direkt mit dem Knochen verbinden und die Knochenneubildung auf ihrer Oberfläche in den frühen Stadien der Implantation fördern13,14. Um die Osseointegration von Ti-basierten Materialien zu verbessern, wurden zwei Hauptmethoden auf der Grundlage von Oberflächenmodifikationen eingesetzt: (1) die Kontrolle der Oberflächentopographie durch physikalische und/oder chemische Veränderungen15,16; (2) die Immobilisierung bioaktiver Moleküle auf der Implantatoberfläche17,18. Der zweite Ansatz, bei dem Beschichtungen verwendet werden, die reich an Proteinen wie Kollagen19 und Rinderserumalbumin (BSA)5,20,21,22 sind, kann die Biokompatibilität von Legierungen auf Ti-Basis verbessern.

Mehrere Studien20,21,22,23,24 zeigten die positiven Auswirkungen auf die Biokompatibilität, wenn Ti-basierte Legierungen mit Protein beschichtet oder Lösungen mit hohen Konzentrationen an BSA, verdünnt mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), ausgesetzt werden. In den Referenzen 20,21,22 wurde gezeigt, dass die Beschichtung mit BSA die Wasserstoffentwicklung und anodische Auflösungsreaktionen hemmt, die Widerstandsfähigkeit der Schutzfilme erhöht und die Zellhaftung an reinem Titan und Ti-basierten Legierungen wie Ti-6Al verbessert -4V, Ti-6Al-7Nb und Ti-6Al-4V-1Zr (in Gew.-%). In ähnlicher Weise wurde auch gezeigt, dass BSA die Stabilität des passiven Legierungsfilms bei höheren Konzentrationen in der Ti-6Al-4V-Legierung verbessert23. Im Fall der Ti-3Cu-Legierung (in Gew.-%), die einer Lösung ausgesetzt wurde, die BSA-Proteine ​​enthielt24, wurde die Korrosionsbeständigkeit verbessert und die antibakterielle Fähigkeit verringert, wenn der BSA-Gehalt in der Lösung zunahm. Allerdings haben nur wenige Studien25,26 gezeigt, dass die Adsorption von Proteinspezies wie BSA auf der Oberfläche von Legierungen auf Ti-Basis die Ionenfreisetzung verstärken und die Adhäsion von Zellen behindern kann.

Trotz der Bedeutung der Proteinbeschichtung für die Verbesserung der Biokompatibilität von Implantaten weisen diese proteinreichen Beschichtungen eine schwache Bindung zum metallischen Substrat auf. Aufgrund einer so schwachen Bindung kann es im Laufe der Zeit zu einer Delaminierung kommen, was dazu führt, dass diese Beschichtungstechnik für eine Langzeitimplantation nicht mehr geeignet ist27,28. Der dauerhafte Einschluss einer zweiten Phase, beispielsweise von Proteinen, in das metallische Material kann eine mögliche Lösung sein, um das Delaminationsproblem proteinbeschichteter Implantate zu vermeiden, es gab jedoch keine Versuche, solche Metall-Protein-Verbundwerkstoffe herzustellen.

Um Biomaterialien mit hoher Festigkeit und guter Biokompatibilität für die Langzeitimplantation herzustellen, werden in dieser Studie die Proteinpartikel als zweite Phase direkt in reines nanostrukturiertes Titan eingefügt. Die Massen-Nanokomposite werden durch eine schwere plastische Verformungsmethode der Hochdrucktorsion (HPT) hergestellt. Die Materialien weisen eine hohe Härte und eine bessere Biokompatibilität als reines Titan auf und weisen keine Delaminierungsprobleme auf, die ein allgemeines Problem bei der Beschichtung mit Proteinen sind. Diese erste Einführung von Metall-Protein-Verbundbiomaterialien eröffnet einen neuen Weg für ein breites Spektrum biomedizinischer Anwendungen.

Zur Herstellung der Biomaterialien wurden Titanpulver mit einem Reinheitsgrad von 99,9 % und Partikelgrößen unter 45 μm sowie BSA-Pulver verwendet. BSA wurde von Amresco (Solon, OH, USA) mit einer Reinheit von 98 % erworben und ohne weitere Reinigung verwendet. Das Titanpulver wurde mechanisch mit BSA-Partikeln in den Anteilen 0, 2 und 5 Vol.-% vermischt. Die resultierenden Pulvermischungen, wie in Abb. 1a–c dargestellt, wurden dann unter einem angelegten Druck von 300 MPa mit einer manuellen hydraulischen Presse zu einer Scheibenform mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Dicke von ~ 1 mm vorverfestigt. Anschließend wurde die HPT-Methode auf die kompaktierten Scheiben angewendet, um die Nanokomposite in großen Mengen mit einem guten Mischungsgrad herzustellen. Bei der HPT-Methode handelt es sich um eine schwere plastische Verformungstechnik, bei der eine scheibenförmige Probe unter hohem Druck zwischen zwei Ambossen komprimiert wird und durch Drehen eines der Ambosse relativ zum anderen eine Scherspannung induziert wird, wie in Abb. 1d 29 dargestellt. Der HPT-Prozess wurde unter 2 GPa bei Raumtemperatur für 5 Umdrehungen mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 1 Umdrehung pro Minute durchgeführt. Die HPT-Methode wurde aus drei Hauptgründen für die Synthese von Verbundwerkstoffen ausgewählt. (1) Diese Methode hat sich als Verfahren etabliert, mit dem nanostrukturierte Materialien mit einer hohen Dichte an Gitterdefekten hergestellt werden können30,31,32,33,34. (2) Das Verfahren kann verwendet werden, um Massenverbundwerkstoffe aus Pulvermischungen bei Umgebungstemperatur herzustellen33,34. (3) Durch HPT verarbeitete nanostrukturierte Ti-basierte Materialien können sowohl eine gute Biokompatibilität als auch eine hohe Festigkeit aufweisen32,33,34,35.

(a,b) SEM-Bilder im BSE-Modus und (c) entsprechende EDS-Elementkartierungen von Ti + 5 Vol.-% BSA vor der HPT-Verarbeitung. (d) Schematische Darstellung der HPT-Methode und ihrer Ambosse29. (d,f,g) SEM-Bilder bei unterschiedlichen Vergrößerungen im BSE-Modus für Ti + 5 Vol.-% BSA-Komposit nach 5 HPT-Umdrehungen unter 2 GPa.

Nach der HPT-Bearbeitung wurden die Proben für die mikrostrukturellen, mechanischen und Biokompatibilitätsuntersuchungen auf eine spiegelähnliche Oberfläche poliert. Die Ergebnisse der mechanischen Eigenschaften und der Biokompatibilität der HPT-verarbeiteten Proben wurden mit einem grobkörnigen Referenz-Reintitan (99,9 %) mit einer durchschnittlichen Korngröße von 200 μm verglichen, das 1 Stunde lang bei 1073 K geglüht wurde.

Zur Untersuchung der Mikrostrukturmerkmale auf Mikrometerebene wurde die Technik der Rasterelektronenmikroskopie (REM) eingesetzt. SEM-Bilder wurden unter Verwendung der Sekundär- und Rückstreuelektronensignale (SE und BSE) unter einer Beschleunigungsspannung von entweder 15 kV mit einem JEOL JSM-7900F-Mikroskop oder 25 kV mit einem FEG Philips XL-30-Mikroskop, ausgestattet mit einem Bruker Nano X-Flash, aufgenommen 6|60 Detektor für energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDS). REM-Bilder wurden in einem Abstand von 4 mm von der Mitte der HPT-verarbeiteten Scheiben aufgenommen.

Transmissions- und Rastertransmissionselektronenmikroskopie (TEM und STEM) wurden mit einer Beschleunigungsspannung von 200 kV unter Verwendung eines aberrationskorrigierten Mikroskops (JEOL JEM-ARM200F) durchgeführt. Für TEM und STEM wurden Scheiben mit 3 mm Durchmesser mit einer elektrischen Entladungsmaschine aus einem Abstand von 2 bis 5 mm von der Mitte der HPT-bearbeiteten Scheibe geschnitten. Die 3-mm-Scheiben wurden zunächst mit Schleifpapier auf eine Dicke von 100 µm geschliffen und später mit einem herkömmlichen elektrochemischen Doppelstrahlpolierer unter Verwendung einer Lösung aus 5 % HClO4, 25 % C3H3(CH2)2CH2OH und 70 auf eine geringere Dicke für Elektronentransparenz geschliffen % CH3OH, unter einer Spannung von 12 V bei einer Temperatur von 263 K. Die mikrostrukturelle Untersuchung mittels TEM und STEM wurde anhand von Hell- und Dunkelfeldbildern (BF und DF), Hochwinkel-Ringdunkelfeldbildern (HAADF) und Selected Area Electron Diffraction (SAED) und EDS-Kartierungen.

Zur Kristallstrukturanalyse wurden die Proben mittels Röntgenbeugung (XRD) unter Verwendung eines X'Pert Panalytical-Diffraktometers untersucht, das mit einem Graphitmonochromator ausgestattet war, der bei 45 kV und 40 mA mit Cu-Kα-Strahlung (Wellenlänge λ = 0,15406 nm) betrieben wurde.

Zur Analyse der mechanischen Eigenschaften wurde die Vickers-Mikrohärte unter Verwendung einer Last von 500 gf und einer Verweilzeit von 15 s auf der oberen Oberfläche der Proben in vier verschiedenen radialen Richtungen von der Mitte zu den Rändern der HPT-verarbeiteten Scheiben gemessen.

Die Biokompatibilität wurde durch zwei Haupttests bewertet: (1) modifizierter 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay; (2) Analyse des Zellzyklus und des DNA-Fragmentierungsprofils mittels Durchflusszytometrie. In der Folge werden Einzelheiten zu Biokompatibilitätstests vorgestellt.

Maus-Präosteoblastenzelllinien (MC3T3-E1) wurden in Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) gehalten, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA, USA) in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 310 K. Die MC3T3-E1-Zellen wurden vom Institut für Biomedizinische Wissenschaften der Universität São Paulo (USP), São Paulo, bereitgestellt , Brasilien.

MC3T3-E1-Zellen mit einer Konfluenz von 80 % wurden trypsiniert und dann mit α-MEM inaktiviert und in einem automatischen Countess II-Zähler (Thermo Fisher Scientific Inc., Walthan, MA, USA) gezählt. Die HPT-verarbeiteten Scheiben wurden in Platten mit 24 Vertiefungen angeordnet (1 Scheibe pro Vertiefung). Die Scheiben wurden durch Einwirkung von ultraviolettem Licht über Nacht in einer Biosicherheitswerkbank sterilisiert und 60 µl Zellsuspension (1 × 105 Zellen) wurden auf die Oberfläche der Scheiben plattiert. Die Platte wurde in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 310 K für einen Zeitraum von 2 Stunden inkubiert. Dann wurde 1 ml α-MEM in jede Vertiefung gegeben und die Platte wurde in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 310 K inkubiert.

Der MTT-Assay dient zur Messung der zellulären Stoffwechselaktivität als Indikator für die Lebensfähigkeit, Proliferation und Zytotoxizität der Zellen. Der MTT-Assay basiert auf der Reduktion eines gelben Tetrazoliumsalzes, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), zu violetten Formazankristallen durch metabolisch aktive Zellen. Nach 48-stündiger Ausplattierung wurden die Kulturmedien abgesaugt und MTT (0,5 mg/ml in PBS) zu den Zellen gegeben und dann 3 Stunden lang in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 310 K inkubiert. Das Wachstumsmedium wurde entladen und entfernt In jede Vertiefung wurden 250 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) gegeben, um MTT aufzulösen. Die Lichtabsorption wurde bei 570 nm mit einem scannenden spektrophotometrischen Multiwell-Plattenlesegerät (F5 Microplate Reader, Molecular Probes) bestimmt.

Für die Durchflusszytometrietests wurden die HPT-behandelten Scheiben in eine Platte mit 24 Vertiefungen gelegt (1 Scheibe pro Vertiefung), 12 Stunden lang in ultraviolettem Licht sterilisiert und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült. In jede Scheibe wurden etwa 1,8 × 105 Zellen plattiert. Nach 48-stündiger Ausplattierung wurden die Zellen geerntet und mit PBS gewaschen. Kaltes Ethanol (70 %) wurde verwendet, um die Zellen 30 Minuten lang zu fixieren, und 50 μg/ml Propidiumiodid (PI), verdünnt in PBS mit 1 mg/ml RNase, wurde 30 Minuten lang zum Färben verwendet. Die Zellen wurden im Dunkeln bei Raumtemperatur gehalten. Der Prozentsatz der Zellen in verschiedenen Phasen des Zyklus wurde durch durchflusszytometrische Analyse basierend auf PI-gefärbten Kernen unter Verwendung der Accuri™ C6-Software (BD Biosciences) bewertet.

Abbildung 1a–c zeigt REM-Bilder einschließlich der EDS-Elementkartierung ausgewählter Elemente der CD vor der HPT-Verarbeitung für ein Komposit mit 5 Vol.-% BSA. In diesem Fall wurde die Oberfläche dieser Probe nicht poliert. Wie aus dem Zusammensetzungskontrast in den BSE-Bildern (Abb. 1a, b) ersichtlich ist, besteht auf Mikrometerebene eine angemessene Vermischung zwischen den Titan- und BSA-Partikeln. Die grauen Partikel beziehen sich auf Titan mit Abmessungen zwischen 10 und 45 μm, während sich die schwarzen Partikel auf das BSA-Protein beziehen. BSA ist ein lineares Polymer mit C-, H-, O-, N- und S-Atomen4. Die in Abb. 1c gezeigte Elementkartierung bestätigt, dass die schwarzen Partikel dem BSA-Protein entsprechen, das Kohlenstoffatome enthält, die von einer Titanmatrix umgeben sind.

Abbildung 1e–g zeigt BSE-Bilder für das Komposit mit 5 Vol.-% BSA nach der HPT-Verarbeitung. Wie der Zusammensetzungskontrast und die EDS-Analyse zeigen, stehen die schwarzen Regionen im Zusammenhang mit dem BSA-Protein. Diese Bilder zeigen, dass das BSA-Protein nach starker plastischer Verformung durch HPT-Verarbeitung mit Titanpartikeln vermischt wird und wohldefinierte Proteinschichten bildet, die über die gesamte Probe verteilt sind, während die Titanphase ihr dreidimensionales Netzwerk behält. Die Fähigkeit von HPT, eine Schichtstruktur aus Titan und BSA zu bilden, ist eine Folge des Scherspannungseffekts auf die ballistische Mikrostrukturentwicklung von Titan und BSA, während ein hoher hydrostatischer Druck die gemeinsame Verformung zweier Komponenten mit unterschiedlichen Strukturen und Eigenschaften erleichtert. Diese Fähigkeit des HPT-Verfahrens wurde bereits zur Herstellung verschiedener Ti-basierter Verbundwerkstoffe wie Metall-Metall-Verbundwerkstoffe36, Metall-Keramik-Verbundwerkstoffe37 und Metall-Kohlenstoff-Verbundwerkstoffe38 genutzt. Hierbei ist zu beachten, dass die in Abb. 1e – g gezeigten Mikrostrukturen auch bei der Untersuchung des Ti-BSA-Verbundwerkstoffs mittels REM aus der Querschnittsansicht beobachtet wurden, ein Merkmal, das normalerweise bei HPT-verarbeiteten Metallen beobachtet wird30.

Untersuchungen der Mikrostruktur in höherer Vergrößerung mit STEM-HAADF und EDS, wie in Abb. 2a, b gezeigt, bestätigen, dass Titan und BSA eine gute Bindung im Nanometerbereich aufweisen. Obwohl zukünftige theoretische Berechnungen erforderlich sind, um die Natur dieser Bindung zu klären, sollten ihre Merkmale denen ähneln, die bei der Absorption von Protein auf Titanimplantaten im menschlichen Körper beobachtet werden. Die Bindung zwischen Titan und Protein erfolgt im Allgemeinen in zwei Schritten: (1) Wasserstoffbrückenbindung und (2) Protonentransfer39. Einige Studien legten nahe, dass eine solche Bindung durch die Wechselwirkung der OH-Gruppe mit Titan verstärkt wird40,41, während Molekulardynamiksimulationen die Bedeutung der elektrostatischen Wechselwirkungen der Amid- und Carboxylgruppen für die Bindung42,43 zeigten.

STEM- und TEM-Analysen für Ti + 5 Vol.-% BSA-Komposit nach 5 Umdrehungen HPT unter 2 GPa. (a) HAADF-Bild und (b) und entsprechende EDS-Abbildung mit Ti; (c,f) TEM-BF-Bilder; (d,g) SAED-Muster entsprechend (c,f); und (c) TEM-DF-Bild.

Die TEM-Analyse wurde eingesetzt, um weitere Merkmale der Mikrostruktur des Verbundwerkstoffs im Submikrometer- und Nanometerbereich zu untersuchen. Abbildung 2 zeigt repräsentative TEM-Bilder für den Verbundstoff mit 5 Vol.-% BSA nach der HPT-Verarbeitung. Die BF- und DF-Bilder (Abb. 2c, e) zeigen das Vorhandensein mehrerer ultrafeiner Titankörner mit Nanometer- oder Submikrometergrößen mit einer durchschnittlichen Korngröße von 90 nm. Das SAED-Muster (Abb. 2d) aus der in Abb. 2c gezeigten Region zeigt gut definierte Ringe, was auf das Vorhandensein ultrafeiner Körner mit zufälliger Ausrichtung in der ausgewählten Region schließen lässt. Die scheinbaren Ringe in Abb. 2d gehören zum Titan mit der hexagonal dicht gepackten (HCP) Struktur. Ein BF-Bild (Abb. 2f) zusammen mit dem entsprechenden SAED-Muster (Abb. 2g), aufgenommen aus einer Region des Verbundwerkstoffs, die das BSA-Protein enthält, zeigt die amorphe Natur von BSA, die durch das im gezeigte Halo-Ringmuster gut charakterisiert ist SAED-Muster.

Abbildung 3 zeigt die XRD-Muster für reines Titan und für Proben mit 2 und 5 Vol.-% BSA nach der Verarbeitung mit HPT. Wie gut zu erkennen ist, zeigen die XRD-Muster aller Proben das Vorhandensein einer einzelnen Phase, die auf die hexagonale Titanstruktur (P63/mmc) verweist, in guter Übereinstimmung mit der TEM-Analyse. Nach der HPT-Verarbeitung treten in den XRD-Mustern keine neuen Phasen auf. Der einzige Unterschied zwischen den XRD-Mustern hängt mit der Abnahme der Intensität der XRD-Peaks mit zunehmendem BSA-Anteil zusammen.

XRD-Muster für reines Titan und für Verbundwerkstoffe mit 2 und 5 Vol.-% BSA nach 5 HPT-Umläufen unter 2 GPa.

Um eine Vorstellung von den mechanischen Eigenschaften von Proben nach der Zugabe von BSA-Protein durch HPT-Verarbeitung zu erhalten, wurde die Vickers-Mikrohärte verglichen, die 4 mm von der Mitte der Scheiben entfernt gemessen wurde, wo die Scherspannung am größten ist. Abbildung 4 zeigt die Durchschnittswerte der Mikrohärte für die Proben nach der HPT-Verarbeitung. Die für die Mikrohärte erhaltenen Werte sind bei den drei HPT-verarbeiteten Proben ziemlich ähnlich, was zeigt, dass die geringen Zugaben von BSA bis zu 5 Vol.-% keinen negativen Einfluss auf die Härte haben. Die gemessenen Werte liegen im Bereich von 344 bis 353 HV, was gut mit den in der Literatur gefundenen Werten für Ti-basierte Legierungen, die mit HPT verarbeitet werden, übereinstimmt34,44. Abbildung 4 zeigt, dass die Härte der Ti-BSA-Verbundwerkstoffe mehr als doppelt so hoch ist wie die Härte des grobkörnigen geglühten Referenztitans.

Vickers-Mikrohärte für reines Titan und für Nanokomposite mit 2 und 5 Vol.-% BSA, hergestellt durch 5 HPT-Umdrehungen unter 2 GPa im Vergleich zur Härte von grobkörnigem geglühtem Titan.

Zu den mechanischen Eigenschaften sind hier zwei Punkte zu erwähnen. Erstens war die Härte in der Mitte der Scheiben am niedrigsten, nahm jedoch mit zunehmendem Abstand von der Scheibenmitte zu, wie in Abb. S1 der Hintergrundinformationen dargestellt. Diese Heterogenitäten, die auf eine Zunahme der Scherspannung mit zunehmendem Abstand von der Scheibenmitte zurückzuführen sind, können vermieden werden, indem die Anzahl der Windungen erhöht wird, sodass die Härtewerte von der Scheibenmitte bis zum Rand den stationären Zustand erreichen29,30. Zweitens führte die Konsolidierung reiner Titanpulver durch HPT zu einer Zugfestigkeit von 1 GPa und einer Duktilität von 12 %45, das Vorhandensein der Proteinphase führte jedoch zu keiner Duktilität unter Spannung, eine Tatsache, die normalerweise bei Metall-Keramik-Verbundwerkstoffen beobachtet wird. Trotz der guten mechanischen Leistung von Verbundwerkstoffen unter Druckbelastung sollte ihre begrenzte Duktilität unter Spannung immer berücksichtigt werden, wenn sie für Anwendungen verwendet werden, einschließlich biomedizinischer Anwendungen46.

Die zelluläre Lebensfähigkeit der Nanokomposite nach der HPT-Verarbeitung wurde durch In-vitro-Zellkulturexperimente unter Verwendung der MC3T3-E1-Zellen bewertet. Die Ergebnisse der Biokompatibilitätsbewertung mittels MTT-Assay sind in Abb. 5 dargestellt. Es ist zu beachten, dass eine höhere Lichtabsorption in Abb. 5 auf eine höhere zelluläre Stoffwechselaktivität hinweist. Erstens weisen alle mit HPT verarbeiteten Proben, wie in Abb. 5 deutlich zu sehen ist, im Vergleich zur grobkörnigen Titanreferenz eine überlegene Biokompatibilität auf. In ähnlicher Richtung zeigte Refs32,34,35 auch die Verbesserung der Biokompatibilität in Legierungen auf Ti-Basis nach der HPT-Verarbeitung. Darüber hinaus zeigten unter den von HPT verarbeiteten Proben in Abb. 5 die Proben, die BSA enthielten, eine bessere Biokompatibilität im Vergleich zu den Proben ohne BSA. Die Verbesserung der Biokompatibilität in den HPT-verarbeiteten Proben scheint proportional zum BSA-Gehalt zu sein, und die Probe mit 5 Vol.-% BSA zeigt das beste Biokompatibilitätsverhalten. Da die adsorbierten Proteine ​​in der Oberfläche des Implantats die Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen einschließlich seiner Differenzierung und Proliferation vermitteln, wird normalerweise erwartet, dass ein besserer Osseointegrationsprozess und folglich eine hervorragende Gewebeintegration auf den Ti-BSA-Nanokompositen erreicht werden, insbesondere in den frühen Stadien der Implantation.

MTT-Zelllebensfähigkeitsassay, untersucht durch Lichtabsorption bei 570 nm für reines Titan und für Nanokomposite mit 2 und 5 Vol.-% BSA, hergestellt durch 5 HPT-Umläufe unter 2 GPa, im Vergleich zur Härte von grobkörnigem geglühtem Titan. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von Experimenten angezeigt, die in vierfacher Ausfertigung durchgeführt und mit der Kruskal-Wallis-ANOVA und paarweisen Vergleichen mit dem Mann-Whitney-Test verglichen wurden.

Abbildung 6 zeigt das Zellzyklusprofil von MC3T3-E1-Zellen für die mittels HPT verarbeiteten Proben, einschließlich einer Titan-Referenzprobe. Die Zellen wurden mit Propidiumiodid (PI) angefärbt, die emittierte Fluoreszenz diente als Pulssignal und die Signalfläche (FL2-A) wurde bestimmt. Für die Zellzyklusanalyse wurden 10.000 Ereignisse im Histogrammdiagramm von FL2-A gesammelt. In Abb. 6a sind die PI-Daten in einem Histogramm dargestellt, mit der Zellzahl auf der y-Achse und der PI-Fluoreszenzintensität auf der x-Achse. Das Histogramm zeigt die Anzahl der Zellen in drei verschiedenen Phasen: G0/G1; S und G2/M für 48 Stunden. Wie in Abb. 6b zu sehen ist, ist die Anzahl der in den G0/G1-, S- und G2/M-Phasen präsentierten Zellen bei allen Proben ziemlich ähnlich, was darauf hindeutet, dass die Zugabe von BSA keine Verzerrung oder Anomalie wie Erhöhung oder Abnahme hervorrief die Anzahl der Zellen in verschiedenen Phasen des Zyklusprofils. Mit anderen Worten: Die Anzahl der Zellen in jeder Phase bleibt während des Zyklusprofils unabhängig von der Zusammensetzung oder dem Verarbeitungsweg unverändert.

Zellzyklusprofil von MC3T3-E1-Zellen. (a) Repräsentatives Histogramm für die Proben, das die Verteilung der Zellen in den einzelnen Phasen des Zellzyklus in den Phasen G0/G1 (Blau), S (Rot) und G2/M (Grün) zeigt. (b) Quantitative Analyse der Verteilung oder des Anteils der Zellzahlen in jeder Phase, durchgeführt anhand von mindestens 10.000 Ereignissen pro Probe. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von Experimenten angezeigt, die in vierfacher Ausfertigung durchgeführt und mit der Kruskal-Wallis-ANOVA und paarweisen Vergleichen mit dem Mann-Whitney-Test verglichen wurden.

Abbildung 7 zeigt die DNA-Fragmentierung von MC3T3-E1-Zellen für die mittels HPT verarbeiteten Proben, einschließlich einer Titanreferenz. In Abb. 7a zeigt das Histogramm der zellulären DNA-Fragmentierung, dass die Proben Werte im Bereich von 1,5 bis 2,0 % für die DNA-Fragmentierung aufweisen. Dies weist darauf hin, dass die BSA-Zugabe oder sogar die HPT-Verarbeitung kein unerwartetes Verhalten in den Proben hervorruft, insbesondere weil die in Abb. 7b gezeigten Werte innerhalb eines sehr engen Bereichs liegen, der signifikante Änderungen unterstützt. Daher induziert die Zugabe von BSA zu Titan, ähnlich der Schlussfolgerung aus der Zellzyklusanalyse, keine Apoptose in MC3T3-E1-Zellen, indem sie die DNA-Fragmentierung nach der Verarbeitung durch HPT erhöht.

DNA-Fragmentierung von MC3T3-E1-Zellen. (a) Repräsentative Histogramme des Prozentsatzes der Zellfragmentierung. (b) Die Anzahl der Zellen mit fragmentierter DNA wird als Prozentsatz angezeigt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von Experimenten angezeigt, die in vierfacher Ausfertigung durchgeführt und mit der Kruskal-Wallis-ANOVA und paarweisen Vergleichen mit dem Mann-Whitney-Test verglichen wurden.

In der vorliegenden Untersuchung wurden Metall-Protein-Nanokomposite mit hoher Festigkeit und guter Biokompatibilität für die Langzeitimplantation eingeführt. Bei den Nanokompositen handelt es sich um Mischungen aus einem biokompatiblen Metall wie Titan und kleinen Mengen eines endogenen Proteins wie 2 und 5 Vol.-% BSA. Für die Synthese dieser neuen Verbundwerkstoffe wurde die HPT-Methode ausgewählt, da die Methode eine gute Mischung auf Nanometerebene zwischen den beiden Phasen gewährleistet und die gewünschte Nanostruktur mit hoher Härte für biomedizinische Anwendungen erreicht.

Die anfängliche Charakterisierung der Metall-Protein-Nanokomposite durch SEM-, STEM-, TEM- und XRD-Analysen ergab interessante mikrostrukturelle Aspekte dieser neuen Biomaterialien. Die Verbundwerkstoffe zeigten einen guten Mischungsgrad zwischen Titan und BSA-Protein sowie das Vorhandensein einer nanokristallinen Struktur, die ultrafeine Titankörner mit einer durchschnittlichen Korngröße von 90 nm enthielt. Die Herstellung ultrafeiner Körner und nanokristalliner Materialien mit erhöhter Härte ist einer der attraktivsten Aspekte von HPT für Biomaterialanwendungen29,30,31,32,33,34,35. Nach dem HPT-Prozess wurden in den Metall-Protein-Nanokompositen keine neuen Phasen identifiziert, was darauf hindeutet, dass die hohe Härte auf die Nanostrukturierung und nicht auf die Bildung der ω-Ti-Phase zurückzuführen ist45. Aufgrund dieser mikrostrukturellen Merkmale wiesen die Metall-Protein-Nanokomposite Härtegrade auf, die doppelt so hoch waren wie die Härte von grobkörnigem Referenztitan. Darüber hinaus hatte die BSA-Zugabe (bis zu 5 Vol.-% BSA) keinen negativen Einfluss auf die Härte, was bestätigt, dass die Proteinzugabe in kleinen Mengen eine praktische Lösung für die Entwicklung hochfester Biomaterialien ist.

Die Biokompatibilität von Metall-Protein-Nanokompositen nach der HPT-Verarbeitung wurde durch direkte Zellkulturexperimente unter Verwendung der MC3T3-E1-Zellen getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass das Metall-Protein-Nanokomposit mit 2 und 5 Vol.-% BSA im Vergleich zu den Referenzen aus reinem nanokristallinem und grobkörnigem Titan eine überlegene Biokompatibilität aufwies. Darüber hinaus zeigte das Komposit mit 5 Vol.-% BSA das beste Biokompatibilitätsverhalten aller Proben. Weitere wichtige Aspekte im Zusammenhang mit der Interaktion von Zellen mit dem Metall-Protein-Nanokomposit wurden auch im Zellzyklusprofil und in den Ergebnissen der DNA-Fragmentierung gezeigt. Diese Tests ergaben eindeutige Beweise dafür, dass die Zugabe von BSA zu Titan keine Verzerrungen oder Anomalien wie eine Erhöhung oder Verringerung der Anzahl von Zellen in verschiedenen Phasen des Zyklusprofils hervorrief und auch nicht die Apoptose in MC3T3-E1-Zellen induzierte Erhöhung der DNA-Fragmentierung nach der Verarbeitung durch HPT. Die überlegene Biokompatibilität der Metall-Protein-Nanokomposite kann auf das Vorhandensein von BSA-Proteinen im gesamten Material einschließlich ihrer Oberflächen zurückgeführt werden, die mit den MC3T3-E1-Zellen interagieren und eine hervorragende Zellproliferation und -adhäsion zeigen. Es ist zu beachten, dass der Temperaturanstieg während der HPT zwar von untergeordneter Bedeutung für die thermische Denaturierung ist47,48, dass jedoch eine Kaltdenaturierung und der Proteinentfaltungsprozess von BSA unter hohem Druck von 2 GPa stattfinden können, wie in früheren Veröffentlichungen vorgeschlagen49,50. Trotz dieser möglichen dreidimensionalen Strukturveränderungen unter hohem Druck bleibt das BSA wirksam, um die Biokompatibilität in aktuellen Ti-BSA-Verbundwerkstoffen zu verbessern.

Dieser positive Biokompatibilitätseffekt aufgrund des Vorhandenseins von BSA in Legierungen auf Ti-Basis stimmt gut mit dem berichteten Effekt der Proteinbeschichtung auf Implantaten überein20,21,22,23,24. Während proteinbeschichtete Implantate lange Zeit unter Delamination leiden, wurde in dieser Studie das BSA-Protein als zweite Phase in Titan durch Kaltkonsolidierung über den HPT-Prozess eingebracht. Daher ist zu erwarten, dass diese neue Familie von Metall-Protein-Nanokompositen deutlich weniger anfällig für das Delaminierungsproblem ist, obwohl Langzeittests erforderlich sind, um dieses Problem zu bestätigen. Da die Kaltkonsolidierung durch HPT auf fast alle Arten von Verbundwerkstoffen anwendbar ist, eröffnet diese Studie einen Weg für das Design und die Synthese einer breiten Palette von Metall-Protein-Nanokomposit-Biomaterialien.

In dieser Studie stellen wir Metall-Protein-Nanokomposite als neue Biomaterialien mit hoher Härte und ausgezeichneter Biokompatibilität vor. Die Nanokomposite wurden durch Mischen von reinem metallischem Titan mit Rinderserumalbumin (BSA), einem endogenen Säugetierprotein, durch Hochdrucktorsion synthetisiert. Aus dieser Studie wurden die folgenden Schlussfolgerungen gezogen.

Die Elektronenmikroskopie zeigte eine gute Vermischung zwischen Titan und BSA-Protein, während die Korngröße von Titan deutlich im Nanometerbereich lag.

Die Mikrohärte von Metall-Protein-Nanokompositen war ähnlich wie bei nanokristallinem Reintitan und mehr als doppelt so hoch wie die von grobkörnigem Reintitan.

Die Röntgenbeugung zeigte, dass die Zugabe von BSA und die anschließende Verarbeitung die Bildung neuer Phasen im Material nicht förderten.

Die zelluläre Lebensfähigkeit von Proben, die durch In-vitro-Zellkulturexperimente mit MC3T3-E1-Zellen bewertet wurde, zeigte, dass die Zugabe von 5 Vol.-% BSA aufgrund der durch die Anwesenheit von BSA-Biomolekülen geförderten verstärkten Zellproliferation zu der besten Biokompatibilität führt.

Die Zugabe von BSA führte zu keiner Veränderung des Zellprofils und der DNA-Fragmentierung, was darauf hindeutet, dass das hier untersuchte Biomaterial eine hervorragende Option für die Verwendung als Implantat mit hoher Härte und hoher Biokompatibilität wäre.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wird teilweise durch Grants-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas des MEXT, Japan (JP19H05176, JP21H00150 & JP22K18737) und von der São Paulo Research Foundation (FAPESP), Brasilien (2019/06951-3) unterstützt. Wir danken Prof. Cecilia Helena de Azevedo Gouveia vom Institut für Biomedizinische Wissenschaften der Universität São Paulo (USP) für die Bereitstellung der MC3T3-E1-Zellen.

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Kaveh Edalati

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Augusto Ducati Luchessi

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RF: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, Schreibarbeit; KE: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, Schreibarbeit; KDP: Methodik, Validierung, Schreibpapier; ADL: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, Schreibpapier.

Korrespondenz mit Ricardo Floriano.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Floriano, R., Edalati, K., Pereira, KD et al. Titan-Protein-Nanokomposite als neue Biomaterialien, hergestellt durch Hochdrucktorsion. Sci Rep 13, 470 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26716-8

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Eingegangen: 20. Juli 2022

Angenommen: 19. Dezember 2022

Veröffentlicht: 10. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26716-8

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